整合单细胞分析揭示小鼠双阴性T细胞的转录异质性

《International Journal of Molecular Sciences》：Integrated Single Cell Analysis Reveals the Transcriptional Heterogeneity of Mouse Double Negative T Cells

　　

双阴性T细胞（DNT cells）是一种罕见的T细胞群体，参与免疫调节、炎症、自身免疫、移植和肿瘤免疫。然而，其低丰度和在组织中的分散分布限制了对它们的细胞组织和转录多样性的系统性理解。为解决这一问题，研究人员开发了一种整合性单细胞框架，利用多个公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集重建了小鼠DNT细胞的跨组织图谱。通过转录组学标准，研究人员鉴定并整合了7984个小鼠RNA定义的DNT细胞。该整合群体被解析为多个转录上不同的细胞簇。这些细胞簇被组织为类初始态（naive like）、促炎性（proinflammatory）、细胞毒性（cytotoxic）、增殖性（proliferative）和髓系相关（myeloid associated）状态，揭示小鼠RNA定义的DNT细胞构成一个高度异质性但有结构的转录区室。整合的下游分析表明这些亚群之间存在转录关系。类初始态群体显示出与炎症和细胞毒性程序的推断转录关系，而虚拟敲除和细胞间通讯分析识别了不同状态间的不同预测调控和信号特征。为了将这些小鼠DNT相关基因置于人类疾病背景下，研究人员将选定基因映射到相应的人类同源基因，并使用TCGA泛癌转录组数据进行了检测。总之，这些发现定义了一个小鼠RNA定义DNT细胞的跨组织转录框架，并为进一步评估这些转录程序在人类DNT生物学中的保守性和相关性提供了基础。更广泛地说，该研究提供了一种通用的整合策略，用于重建和表征在单个单细胞数据集中代表性不足的罕见免疫细胞群体。

论文解读：整合单细胞分析揭示小鼠双阴性T细胞的转录异质性

双阴性T细胞（DNT cells）是缺乏CD4和CD8表达的成熟T淋巴细胞亚群，参与免疫调节、炎症、自身免疫、移植和肿瘤免疫。尽管其功能多样，但由于DNT细胞在体内丰度极低且分散分布于不同组织，传统流式细胞术和功能实验难以系统解析其内部异质性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为研究稀有免疫细胞提供了可能，但单个数据集中的DNT细胞数量往往有限，且不同研究通常聚焦于特定疾病或组织环境，缺乏跨组织的统一视角。因此，研究人员提出一种整合性单细胞分析框架，通过合并多个公共数据集，重建小鼠DNT细胞的跨组织转录图谱，以系统界定其转录状态及相互关系。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

研究人员从GEO公共数据库收集了66个小鼠样本，组织来源包括结肠、耳、肢体肌肉、肝、肺、淋巴组织、皮肤和脾。首先建立严格的RNA水平筛选标准：候选细胞需表达阳性T细胞相关基因（Ptprc、Cd3d、Cd3e、Cd3g、Trac、Trbc2），同时不表达CD4、CD8a、CD8b1、Trdc和Klrb1c。通过此标准，共鉴定出7984个RNA定义的小鼠DNT细胞。随后进行质量评估、Harmony跨组织整合、无监督聚类、标记基因注释、轨迹推断、虚拟敲除、配体受体通讯分析，并将小鼠标记基因映射到人类同源基因，利用TCGA泛癌数据评估其潜在疾病相关性。

主要技术方法包括：基于Seurat对每个来源数据集分别进行细胞质量控制（检测基因数、总转录本数、线粒体转录本比例），使用Harmony以组织来源为分组变量进行批次整合，通过UMAP降维和基于图的聚类识别细胞簇；采用Monocle和URD进行伪时间轨迹推断；利用scTenifoldKnk对代表性基因进行虚拟敲除，预测基因调控网络变化；使用CellPhoneDB进行配体-受体介导的细胞间通讯分析；同时将小鼠基因转换为人类同源基因，在TCGA