《International Journal of Molecular Sciences》：Integration of Single-Cell and Bulk RNA Sequencing Data to Identify Lactylation-Related Gene Signatures in Hepatic Ischemia–Reperfusion Injury Using Machine Learning Algorithms
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肝缺血-再灌注损伤（HIRI）不仅是肝移植和主要肝脏手术的常见并发症，也是术后预后的关键决定因素。研究人员已在HIRI中观察到乳酸代谢重编程，但乳酸及其相关乳酸化在HIRI发病机制中的作用仍不清楚。为此，研究人员整合单细胞与批量RNA测序数据并采用多种生物信息
肝缺血-再灌注损伤（HIRI）不仅是肝移植和主要肝脏手术的常见并发症，也是术后预后的关键决定因素。研究人员已在HIRI中观察到乳酸代谢重编程，但乳酸及其相关乳酸化在HIRI发病机制中的作用仍不清楚。为此，研究人员整合单细胞与批量RNA测序数据并采用多种生物信息学方法。研究人员应用五种单细胞基因集活性评分方法（AUCell、UCell、singscore、ssGSEA、AddModuleScore）评估各细胞类型中的乳酸化活性，随后进行差异表达基因（DEG）分析与高维加权相关网络分析（hdWGCNA）以识别乳酸化相关基因。研究人员使用五种机器学习算法（随机森林、Boruta、LASSO、GBM、决策树）筛选最优特征基因，并进一步用SHAP分析解释其重要性。来自Gene Expression Omnibus（GEO）数据库的批量RNA测序数据用于验证。此外，研究人员使用ChEMBL在线工具筛选NR4A3相关抑制剂，并通过分子对接与分子动力学模拟进行评估。研究人员观察到HIRI中不同细胞类型的乳酸代谢活性存在显著异质性，肝细胞与单核吞噬细胞活性较高。SHAP与机器学习整合识别出PFKFB3、ZYX与NR4A3与HIRI后高乳酸化密切相关，与批量RNA数据交叉分析证实其一致上调。候选基因表达通过小鼠肝脏IRI模型中的Western blotting与RT-qPCR实验验证。尽管乳酸化既往已在HIRI中被报道，本研究独特贡献在于通过多组学整合与机器学习在单细胞水平揭示乳酸化相关基因表达的细胞类型异质性。NR4A3、PFKFB3与ZYX作为乳酸化相关调节因子的识别为改善肝移植移植物存活提供了新治疗靶点。
研究背景方面，肝缺血-再灌注损伤（HIRI）是肝切除、肝移植和失血性休克中常见的严重临床问题，可导致肝功能障碍甚至多器官衰竭，并影响移植后预后、增加急性排斥、肿瘤复发与纤维化风险。其病理机制涉及有氧代谢障碍、氧化应激、巨噬细胞极化、线粒体功能障碍与炎症介质等，但分子事件尚未完全阐明。乳酸化（Lactylation，乳酸基团共价连接赖氨酸残基的翻译后修饰）作为代谢-表观遗传开关，在多种器官IRI中被关注；HIRI中已有PCK2乳酸化促铁死亡、HSPA12A调控HMGB1乳酸化等报道，但乳酸化在HIRI中的系统性与细胞异质性仍缺乏研究。因此，研究人员开展本研究以整合单细胞与批量RNA测序及机器学习，识别HIRI中乳酸化相关基因特征与新靶点。
本研究发表在《International Journal of Molecular Sciences》。研究人员整合scRNA-seq与bulk RNA-seq，经评分、网络、机器学习与实验验证，得出NR4A3、PFKFB3、ZYX为HIRI高乳酸化核心基因，主要富集于单核吞噬细胞/巨噬细胞与单核细胞，并在小鼠模型中上调；该研究意义在于首次在单细胞水平揭示HIRI乳酸化基因表达的细胞异质性，并为肝移植移植物保护提供NR4A3等可成药靶点方向。
主要关键技术方法上，研究人员使用GEO中scRNA-seq数据集GSE171539（1例灌注前、1例再灌注后）及bulk数据集GSE12720（21对21）与GSE112713（11对11）；以Seurat进行单细胞处理与Harmony校正，用AUCell、UCell、singscore、ssGSEA、AddModuleScore算乳酸化活性；以hdWGCNA建共表达网络；以LASSO、随机森林、Boruta、GBM、决策树筛特征并用SHAP解释；以Monocle2与CytoTRACE做轨迹与分化状态分析；以CellChat做细胞互作；以scTenifoldKnk做NR4A3虚拟敲除；以ChEMBL、AutoDock Vina与分子动力学模拟预测NR4A3抑制剂；以小鼠70%肝缺血60分钟再灌注6小时模型做WB、RT-qPCR、IHC、IF与TUNEL验证。
研究结果如下。2.1 利用scRNA-seq分析HIRI中乳酸化相关基因（LRGs）复杂性：研究人员将细胞分13簇8类，用五种评分显示肝细胞乳酸化活性高，内皮细胞、NK/T细胞、单核吞噬细胞在HIRI中显著升高，据此分高/低乳酸化细胞组。2.2 hdWGCNA识别关键基因：软阈值6建7模块，取top hub与DEG交集得64个枢纽基因。2.3 多机器学习算法识别促乳酸化核心基因：五算法共同选出NR4A3、PFKFB3、ZYX。2.4 SHAP分析与bulk水平验证：NR4A3平均SHAP最高，GSE12720与GSE112713中三基因均上调且AUC良好。2.5 单细胞水平验证最优特征基因：PFKFB3与ZYX在单核吞噬细胞高表达，NR4A3在单核吞噬细胞与B细胞表达；巨噬细胞中NR4A3、PFKFB3高，单核细胞ZYX高。2.6 轨迹分析与细胞互作：NR4A3+/PFKFB3+巨噬细胞与ZYX+单核细胞分化状态较幼稚，NR4A3+巨噬通过LGALS9-CD45、HLA-DRB5-CD4、APP-CD74等配体-受体增强细胞通讯。2.7 NR4A3虚拟敲除转录改变：缺失后SESN1、BACH2、BTLA、TCL1A等变化，富集于白细胞黏附、PI3K-Akt信号等。2.8 NR4A3靶向抑制剂与分子动力学验证：CHEMBL5419098（IC50 0.69 nM）与CHEMBL5563563（3.8 μM）对接分数-8.3与-7.9 kcal/mol，RMSD、Rg、SASA、RMSF与氢键分析显示复合体稳定。2.9 小鼠HIRI模型验证全局乳酸化与关键LRGs：HIRI组ALT/AST升高、TUNEL阳性增加、乳酸与Pan-Lactyl-lysine上升，NR4A3、PFKFB3、ZYX的mRNA与蛋白均上调。
讨论部分总结：研究人员指出HIRI是肝移植早期移植物失败重要因素，乳酸化可调控炎症与代谢适应。NR4A3为孤儿核受体，可影响ROS、凋亡与组蛋白乳酸化；PFKFB3调控果糖-2,6-二磷酸与糖酵解，关联炎症与组织损伤；ZYX位于黏附斑与肌动蛋白骨架，参与单核细胞与巨噬细胞功能。CellChat显示NR4A3+巨噬细胞与ZYX+单核细胞通过APP-CD74、LGALS9-CD45等轴放大炎症。局限性包括scRNA-seq无生物学重复、LRG列表源自肿瘤文献、抑制剂仅计算模拟、动物实验未做基因敲除因果验证。
结论部分翻译：总之，本研究整合转录组学分析与实验验证，识别NR4A3、PFKFB3与ZYX为肝移植HIRI中的关键乳酸化相关基因（LRGs）。这些在单细胞RNA测序与bulk数据及小鼠HIRI模型中识别的关键LRGs，在机制上与乳酸驱动的代谢重编程和炎症活化相关。通过将乳酸代谢联系到表观遗传与炎症网络，本研究为靶向移植物损伤和改善移植结局的治疗策略提供概念基础。未来工作应聚焦乳酸化位点特异性修饰及LRG靶向干预的临床评价，以提升肝移植结局。
