《Antibiotics》：Next-Generation Antimicrobial Peptides for Biofilm-Associated Infections: Engineering, Biomaterial Delivery and AI-Assisted Discovery
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抗菌肽因其广谱活性、快速杀菌、抗生物膜潜力、免疫调节特性以及与许多传统抗生素不同的作用机制，正日益被视为下一代抗菌剂。尽管具有这些优势，但其临床转化仍受到蛋白酶解不稳定性、溶血或细胞毒性、药代动力学不佳、盐和血清敏感性、生产成本以及递送挑战的限制。因此，抗菌肽
抗菌肽因其广谱活性、快速杀菌、抗生物膜潜力、免疫调节特性以及与许多传统抗生素不同的作用机制，正日益被视为下一代抗菌剂。尽管具有这些优势，但其临床转化仍受到蛋白酶解不稳定性、溶血或细胞毒性、药代动力学不佳、盐和血清敏感性、生产成本以及递送挑战的限制。因此，抗菌肽领域正从天然肽发现转向整合了合理肽修饰、基于生物材料的递送、高通量筛选和人工智能（AI），特别是机器学习（ML）和深度学习方法的工程化管线。化学和结构修饰，包括D-氨基酸取代、N-甘氨酸取代、环化、脂化、聚乙二醇化、末端酰胺化、烃基订书肽化、杂交、序列截短、金属配位以及生物材料固定化，被用于改善稳定性、效力、选择性、抗生物膜活性和组织定位。与此同时，人工智能引导的方法，包括机器学习、深度学习和生成式建模，能够大规模探索多样化的肽源，包括微生物组和已灭绝蛋白质组，直至全新的序列，同时支持对效力、选择性、稳定性、毒性和可合成性的优化。本专题综述总结了在抗菌药物耐药性背景下，针对生物膜相关感染的抗菌肽工程化改造、生物材料辅助递送和人工智能引导发现方面的最新进展。
1. 引言
抗菌药物耐药性的全球性上升加剧了对作用机制超越传统抗生素的治疗分子的需求。世界卫生组织将抗菌药物耐药性视为全球公共卫生和发展的最大威胁之一。抗菌肽代表了自然界中最古老且最保守的抗菌策略之一。它们通常由10至50个氨基酸组成，富含正电荷和疏水残基，赋予其两亲性特征，有利于与带负电的细菌膜发生静电相互作用。尽管早期发现了短杆菌肽等肽类抗生素，但由于传统小分子抗生素的主导地位以及肽类药物自身的局限性，抗菌肽的治疗开发在数十年间相对有限。近年来，由于耐药性增加、持续性生物膜相关感染的出现以及对具有不同于经典抗生素机制的抗菌策略的需求，对抗菌肽的兴趣重新燃起。这种新的关注也得益于抗菌肽的多功能性，它可能将直接的抗菌活性与免疫调节、内毒素中和、伤口愈合支持、抗生物膜活性以及现有抗生素的协同作用相结合。近期研究证实了这一趋势，例如报道了针对多重耐药金黄色葡萄球菌及其生物膜的两亲性肽，以及源自微生物组的、对WHO优先病原体鲍曼不动杆菌具有治疗活性的抗菌肽。与许多通过高度特异性酶促或生物合成靶点起作用的小分子抗生素不同，抗菌肽通常通过与微生物膜的物理化学相互作用来发挥作用，这使得耐药性的产生更为复杂，但并非不可能。一旦与微生物表面结合，抗菌肽可能导致膜透化、孔形成、膜变薄、脂质簇集、去极化或去垢剂样破坏。然而，抗菌肽不应仅仅被理解为膜破坏剂，许多肽还能穿过膜并干扰细胞内过程，包括DNA、RNA、蛋白质合成、细胞壁合成、代谢途径和应激反应系统。例如，细胞内活跃的抗菌肽可以结合核酸、抑制核糖体翻译、干扰蛋白质折叠、抑制酶或破坏必需代谢途径。最近的抗菌肽研究也已扩展到生物膜相关感染，因为生物膜是嵌入在细胞外聚合物物质中的结构化微生物群落，能保护细菌免受抗生素、免疫攻击和应激。抗菌肽在此背景下具有前景，因为它们可以作用于浮游细胞、干扰早期粘附阶段的生物膜形成、破坏成熟生物膜或靶向持留菌样细胞，并使生物膜内细菌对常规抗生素敏感。尽管有这些前景，但只有少数抗菌肽进入了临床应用，主要障碍包括蛋白酶解降解、生理盐或血清条件下活性降低、溶血、哺乳动物细胞毒性、半衰期短、组织分布差、免疫原性问题和制造成本。因此，目前的研究前沿不仅是发现新的抗菌肽，更是通过序列工程化、化学修饰、制剂、表面固定化和计算设计对其进行优化。这种转变对于伤口愈合和皮肤接触应用尤为重要。慢性感染伤口是生物学上复杂的环境，含有过度的蛋白酶活性、炎性渗出物、受损的组织修复、多种微生物定植和生物膜形成。水凝胶敷料、伤口敷料和局部生物材料平台提供了一种有吸引力的策略，可将抗菌肽从短效的可溶性抗菌剂转化为具有可控释放、改善稳定性、减少全身暴露并与组织修复过程更好整合的局部保留生物活性分子。与此同时，用于这些应用的抗菌肽设计正变得越来越依赖计算驱动。一个特别重要的转变发生在过去几年：抗菌肽发现正从逐个生物体筛选转向人工智能辅助的巨大肽序列空间探索。例如，利用机器学习挖掘数以万计的宏基因组和原核基因组，生成了一个包含超过86万个非冗余候选抗菌肽的目录。同样，基于深度学习的“分子去灭绝”技术已被用于从已灭绝生物体中挖掘超过1000万个肽。这些研究说明了一个新范式，即计算模型不仅用于分类已知肽，也用于揭示隐藏的、隐秘的或全新的抗菌序列空间。
2. 抗菌肽作为抗菌和抗生物膜剂
抗菌肽目前被研究用于四个互补的角色：直接抗菌剂、抗生物膜剂、抗生素佐剂以及抗菌生物材料的功能组分。
2.1. 抗菌肽作为直接抗菌剂
作为直接抗菌剂，抗菌肽正被探索用于对抗革兰氏阳性和阴性多重耐药病原体。其快速的膜相关活性和多靶点物理化学机制可能降低经典单靶点耐药的可能性。然而，抗菌肽并非完全无耐药风险，耐药倾向应被视为重要的设计和开发参数。一项系统性实验进化研究表明，抗生素适应的大肠杆菌系耐药性中位数增加了约90倍，而抗菌肽适应的系显示出显著更低且更异质的耐药性，这凸显了耐药倾向是一个重要的抗菌肽设计参数。
2.2. 抗菌肽作为抗生物膜剂
抗菌肽在对抗生物膜相关感染方面尤其具有吸引力，因为其膜相关和物理化学作用模式可能同时对代谢活跃和缓慢生长或持留菌样的附着细菌有效。常见的三种抗生物膜功能包括：抑制早期细菌粘附、破坏或削弱已建立的生物膜生物量、以及杀死或敏化耐受的生物膜相关细胞。多项研究证实，选定的抗菌肽能杀死静止期细菌和非分裂的持留菌，并在成熟生物膜模型中根除耐甲氧西林金黄色葡萄球菌持留菌。这些研究共同表明，抗菌肽在生物膜相关感染中的价值不在于单一的通用机制，而在于其在多个生物膜阶段发挥作用的能力。
2.3. 抗菌肽作为抗生素佐剂
抗菌肽也可作为抗生素佐剂发挥作用。通过增加膜通透性或削弱生物膜结构，抗菌肽可以增强抗生素积累或在耐受或耐药细菌群体中恢复其敏感性。例子包括一种非膜活性肽使耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素重新敏感化，以及通过共价连接万古霉素与膜活性肽MSI-78生成的万古霉素-抗菌肽偶联物，其抗菌活性整体提升了约20倍，并拓宽了对万古霉素耐药菌和革兰氏阴性菌的活性。
2.4. 抗菌肽与抗菌肽启发的抗菌生物材料
除了可溶性肽-抗生素组合，基于抗菌肽的策略越来越多地被整合到生物材料中，以提供局部和持续的抗菌活性。这在伤口、导管、骨科植入物等环境中尤为相关。抗菌肽负载或功能化的材料可以作为局部储库，用于控制肽释放，或作为接触杀灭表面。这一概念也已扩展到抗菌肽启发的抗菌大分子材料，如基于阳离子均聚多肽的纳米涂层，它们通过静电相互作用与细菌包膜作用并引起膜扰动，但与经典的离散序列抗菌肽有所区别。
3. 改善抗菌肽性能的工程化和修饰策略
抗菌肽工程化旨在通过提高抗菌效力和稳定性，同时降低对哺乳动物细胞的毒性来改善治疗指数。常见的修饰策略包括氨基酸取代、D-氨基酸掺入、N-取代甘氨酸掺入、环化、脂化、聚乙二醇化、末端修饰、烃基订书肽化、杂交、序列截短和金属配位。
3.1. D-氨基酸取代
D-氨基酸取代是增加蛋白水解稳定性的最广泛使用的策略之一。用D-氨基酸替换可减少酶促降解，延长肽活性。例如，由D-色氨酸、D-精氨酸和D-赖氨酸重复单元组成的线性肽在暴露于消化蛋白酶后保留了超过90%的完整肽，而相应的L-氨基酸肽则保留不到10%。此外，D-氨基酸取代也可能影响肽构象、膜相互作用和免疫识别。
3.2. 拟肽
拟肽是由N-取代甘氨酸残基构成的肽模拟物，其主链缺乏N-H氢键供体，导致高蛋白水解稳定性，但也改变了构象行为。例如，一种称为TM18的脂-拟肽对金黄色葡萄球菌和双物种生物膜显示出显著的抗生物膜效果，并与美罗培南具有协同作用。拟肽在可扩展性方面也具有优势，存在多种聚合化学方法可用于其合成。
3.3. 拓扑工程化：环化、分支和多价架构
环化可以通过约束构象和降低对外切或内切肽酶的敏感性来提高肽稳定性。实例显示环肽在弹性蛋白酶暴露后保留了抗菌活性，而线性螺旋肽则失去活性。环化可通过头尾连接、二硫桥等方式实现。分支创建具有多个肽臂从核心伸出的多价三维结构，可改善多价性、空间展示和膜相互作用。研究表明，分支聚-L-精氨酸结构与线性类似物相比具有更强的抗菌活性。
3.4. 脂化
脂化涉及脂肪酸链或脂基团的缀合，以增加疏水性和膜亲和力。这可以显著提高抗菌效力，但增加的疏水性也可能增加溶血和细胞毒性。脂链长度、附着位点、接头大小和净电荷必须经过优化以维持细菌选择性。
3.5. 聚乙二醇化和聚合物缀合
聚乙二醇化和聚合物缀合用于改善溶解度、循环时间和药代动力学。研究表明，梳状聚乙二醇-抗菌肽缀合物比星形类似物显示出更高的螺旋度、溶解度、抗菌活性和蛋白水解稳定性。然而，聚合物屏蔽也可能因掩蔽阳离子或两亲性区域而降低抗菌活性。
3.6. 末端酰胺化和序列优化
C-末端酰胺化常见于天然和合成抗菌肽，可增加净正电荷、改善螺旋度和膜结合。合理的序列优化可用于微调抗菌肽的电荷、两亲性和毒性。掺入非天然氨基酸是另一种扩大化学多样性的策略。
3.7. 烃基订书肽化
烃基订书肽化是一种主要应用于α-螺旋抗菌肽的构象约束策略，通过引入α,α-二取代非天然氨基酸并进行烯烃复分解反应，生成全碳氢桥来稳定螺旋构象。正确位置的订书肽化可以改善抗菌活性和蛋白酶抗性，但错误放置可能破坏两亲性螺旋或增加毒性。
3.8. 杂交和截短
杂合肽合并两个或多个母体抗菌肽的基序以融合理想特性。序列截短可降低合成成本并去除有毒或不稳定区域。这些策略通常通过迭代设计进行，而非简单的序列融合或缩短。
3.9. 金属配位
金属配位是一种新兴策略，通过肽序列中的金属结合残基与过渡金属离子相互作用来调节结构和功能。这种相互作用可作为构象开关，改变电荷分布和膜亲和力。该技术还可用于通过靶向细菌外膜上的磷酸基团来改善选择性。然而，金属-抗菌肽复合物需评估金属释放、氧化还原活性和宿主细胞毒性。
4. 生物材料固定化和递送系统
对于生物膜相关感染，抗菌肽的功效不仅取决于肽序列，还取决于肽能否被保留在感染界面、免受降解或稀释，并以足够浓度呈现以阻止细菌粘附或破坏生物膜。
4.1. 表面固定化和抗菌肽功能化界面
可溶性抗菌肽在复杂的生物环境中常因稀释、降解或隔离而失活。表面固定化通过在易感界面（如伤口、导管）局部化肽活性来解决这些限制。研究表明，共价固定化可以将可溶性抗菌肽转化为局部的、非浸出的接触杀灭表面，具有改善的血清稳定性和减少的全身暴露。一种改善局部滞留和组织相容性的方法是结合抗菌活性和细胞粘附基序，如Arg-Gly-Asp，以防止细菌定植同时维持宿主细胞识别和再增殖的表面。
4.2. 基于纳米载体的抗菌肽递送系统
纳米载体递送系统旨在保护抗菌肽、增加其局部滞留并控制在感染部位的释放。基于生物聚合物的纳米载体，如壳聚糖-硫酸葡聚糖纳米网络，可以封装抗菌肽，保护其免受蛋白酶降解，并在体外和离体猪皮肤感染模型中保持活性。水凝胶基抗菌肽储库也被研究为伤口相容的递送平台。更先进的纳米载体系统正在设计用于结合抗菌活性和伤口愈合功能。总体而言，纳米载体系统可以改善抗菌肽的性能，但也引入了封装效率、释放动力学和制造复杂性等挑战。
5. 人工智能引导的抗菌肽发现和设计
人工智能正在通过实现对远大于实验可筛选范围的肽序列空间的系统性探索来变革抗菌肽研究。
5.1. 基于机器学习的生物学和宏基因组数据集挖掘
AMPSphere研究是利用机器学习在全球范围内挖掘抗菌肽候选物的里程碑式工作，生成了超过86万个非冗余候选物，其中大部分与已知数据库相似性有限。这种挖掘策略正扩展到环境微生物组，如污泥和极端微生物组。人工智能还允许研究人员探索经典筛选无法实现的生物学空间，例如通过深度学习挖掘已灭绝蛋白质组进行“分子去灭绝”。
5.2. 基础模型和肽语言模型
蛋白质和肽语言模型被用于在高维嵌入空间中表示肽序列，支持预测、生成和优化任务。例如，基于大型语言模型的AMP-Designer在11天内设计了18种从头合成的广谱抗菌肽，体外验证成功率达94.4%，整个设计到验证管线在48天内完成。
5.3. 生成式设计
生成模型允许抗菌肽研究从预测转向设计。潜在扩散模型、条件变分自编码器等方法被用于生成具有所需抗菌、结构或物理化学性质的新肽。最新的框架专注于病原体靶向和属性可编程设计，如知识感知提示扩散模型KPPepGen。
5.4. 多目标优化
人工智能引导的抗菌肽开发的下一步是决定如何改进肽，包括确定有益取代、选择立体化学修饰位点、降低毒性以及优化抗生物膜活性。ADAPT平台预测哪些位置可转换为D-氨基酸以保持或改善功能，而ApexGO结合贝叶斯优化进行序列突变/取代。针对抗生物膜和抗菌导向的人工智能设计也在兴起，如MOFormer和MPOGAN，它们在单个生成管线中同时优化抗菌活性、溶血和毒性等多个目标。
5.5. 走向标准化基准测试框架
尽管人工智能引导的抗菌肽发现进展迅速，但缺乏标准化的基准测试框架仍是一个关键局限。最近的一些倡议开始解决这一问题，引入了同源性感知基准、多标签分类基准和统一框架。未来评估管线应超越二元分类，纳入实验性指标如抗菌效力、溶血毒性、选择性指数、蛋白水解稳定性和抗生物膜活性。
6. 转化挑战
尽管抗菌肽研究正在迅速扩展，但转化仍然困难。已有几种抗菌肽或类似物进入临床试验，但广泛的临床批准仍然有限。例如pexiganan和LTX-109主要在局部应用中取得进展。标准的体外效力并不总能转化为体内或临床疗效，因为许多抗菌肽在血清蛋白、盐、宿主蛋白酶或生物膜基质存在下会失去活性。毒性是另一个核心挑战，需要从简单的溶血和细胞毒性测定转向组织相关模型，如离体人体皮肤外植体。耐药性发展也必须考虑，细菌可通过表面电荷修饰、蛋白酶分泌等方式进化出降低的敏感性。最后，制造和监管问题也很重要，肽合成成本高，批次重现性、纯度和免疫原性等问题必须在临床开发前解决。
7. 结论
抗菌肽代表了一类有前景但仍未充分转化的用于生物膜相关感染的抗菌剂。未来的进展将更少依赖于分离孤立的强效序列，而更多依赖于设计完整的基于抗菌肽的系统，该系统结合了抗菌效力、抗生物膜活性、选择性、稳定性、可制造性和临床相关的递送。一个主要的优先事项是将抗菌肽评估推进到标准浮游最小抑菌浓度测定之外，纳入生物膜相关终点。人工智能方法可以加速这一转变，帮助识别新的肽序列以及最有希望的修饰和性质组合。生物材料递送也应被视为抗菌肽开发的一部分，而不是一个事后的想法。
