靶向甲型肝炎病毒IB亚基因型3C蛋白酶：虚拟筛选与强效先导候选物的鉴定

《Microorganisms》：Targeting the 3C Protease of Hepatitis A Virus Subgenotype IB: Virtual Screening and Identification of Potent Lead Candidates

　　

甲型肝炎病毒（HAV）感染在发展中国家与发达国家中仍是全球公共卫生问题。研究人员使用AutoDock Vina建模软件鉴定抗HAV药物，并在体外进行评价。在对Huh7细胞进行细胞毒性检测后，从10个化合物中筛选出5个。研究人员评价了对HAV IB基因型HM175/18f与HAV IIIA基因型HA11-1299感染人肝癌细胞具有活性的HAV 3C蛋白酶（3Cpro）抑制剂。在这5个化合物中，研究人员仅确定1个（KCN-A-12）对HAV IB基因型HM175/18f与HAV IIIA基因型HA11-1299在人肝癌Huh7细胞中复制均有抑制作用。KCN-A-12对HAV IB基因型HM175/18f复制的抑制效果强于HAV IIIA基因型HA11-1299。该差异可能源于发现体系依赖于基于HAV IB基因型HM175毒株的HAV 3Cpro晶体结构。总之，研究人员观察到KCN-A-12能够抑制HAV复制。针对HAV 3Cpro的计算机筛选可用于抗HAV药物的进一步发现。

研究背景方面，甲型肝炎病毒（HAV）感染在发展中国家与发达国家中仍是具有威胁的疾病，2021年全球HAV发病与死亡负担仍重，且可通过食物、人际接触及男男性行为人群（MSM）传播。虽然HAV疫苗可用于预防，但韩国、日本等国家和地区年轻成人保护抗体不足，疫情仍发生。目前缺乏可用于暴露前预防（PrEP）或暴露后预防（PEP）的抗HAV药物，因此开发靶向HAV 3C蛋白酶（3C^pro，病毒多蛋白加工关键酶）的抗病毒药物具有重要意义。研究人员此前已用Schr?dinger从25000个抗病毒库筛得Z10325150，本研究改用AutoDock Vina，从更大多样化ZINC来源商业库筛选，并以多参数策略寻找先导物。论文发表于《Microorganisms》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用AutoDock Vina v1.2.5对HAV 3C^pro晶体结构（PDB ID: 2CXV）进行分子对接，网格覆盖催化残基His44、Asp84、Cys172及氧阴离子孔区域；配体来自ZINC数据库并由Combi-Blocks商业化提供，用Avogadro 2、Open Babel、Meeko、RDKit处理为PDBQT格式，用ChemDraw计算cLogP；以配体效率（LE，LE=?S/N，S为最佳Vina分数，N为重原子数）进行尺寸无关比较；用Huh7细胞、HAV IB基因型HM175/18f与HAV IIIA基因型HA11-1299进行感染模型；以MTS与台盼蓝排除法测细胞活力，以实时RT-PCR用ddCt法量化HAV RNA/β-actin mRNA，用Student t检验分析。

3.1. Docking of the Selected Compound Series

研究人员将KCN-A-11至KCN-A-20对接至HAV 3C^pro催化区，最佳Vina分数?7.612至?5.752 kcal mol^?1，分子量253.35至413.42 g mol^?1，重原子18至27，LE 0.247至0.328；KCN-A-13的cLogP 5.59略超阈值。 docking分数与抗病毒活性无直接相关，KCN-A-12分数仅?5.835却活性最强，说明对接主要用于评估结合模式而非定量预测细胞抗病毒效价。

3.2. Effects of 10 Compounds on Survival of Huh7 Cells

研究人员用MTS法测10个化合物72小时对Huh7活力影响，KCN-A-13、KCN-A-16、KCN-A-17、KCN-A-18、KCN-A-20在100 μg/mL明显降活力，另5个不显著，故选KCN-A-11、KCN-A-12、KCN-A-14、KCN-A-15、KCN-A-19用于复制抑制筛选。

3.3. Effects of Five Compounds on HAV Genotype IB HM175/18f Replication in Huh7 Cells

研究人员在感染IB株后加100 μg/mL化合物48小时，五个均显著抑制HAV IB复制（p<0.05）；KCN-A-12把复制压到对照3.4%，IC₅₀ 37.5 μg/mL；以细胞半数抑制浓度/抗病毒IC₅₀算选择性指数（SI）均>1.0，说明安全性窗口有利。

3.4. Effects of KCN-A-12 on HAV Genotype IIIA HA11-1299 Replication in Huh7 Cells

研究人员用KCN-A-12处理IIIA株感染Huh7细胞，100 μg/mL 48小时显著降低HAV IIIA复制，SI仍>1.0，证明KCN-A-12对IB与IIIA两基因型均有效，但对IB更强。

3.5. Predicted Binding Mode of the Lead Compound KCN-A-12

研究人员用ChimeraX与Discovery Studio分析 pose，KCN-A-12位于底物结合沟，芳香环朝向Cys172与His44，存在π–硫接触、疏水/π–烷基接触涉及Val144、Lys146、Pro169、Ala193、Gly194，范德华接触涉及Met29、His44、His145、Gly167、Leu168、Gly170、Met171、His191；靠近Gly170–Met171–Cys172段与氧阴离子孔，部分骨架指向S1口袋；选定pose中氮杂环丁醇羟基未形成常规氢键，整体为空间占位阻断底物进入催化机器。

讨论部分总结，研究人员指出HAV 3C^pro晶体多基于IB HM175，故先测IB再测IIIA；100 μg/mL初筛浓度较高，但KCN-A-12按分子量折合约394 μM，IB的IC₅₀为148 μM，台盼蓝法细胞CC₅₀ 192 μg/mL（759 μM），SI 5.12。KCN-A-12对IB复制到3.4%、对IIIA恢复到39.3%，优于既往Z10325150对IIIA的69.6%。研究人员承认局限：未测上清感染病毒/蛋白表达、未做不同MOI、未用非IB结构、缺蛋白酶酶活/分子动力学/体内验证、可进一步结构优化。总体认为计算机筛选HAV 3C^pro先导物是抗HAV药物发现可行路径。

结论部分翻译：研究人员评价了针对HAV IB基因型HM175/18f与HAV IIIA基因型HA11-1299感染人肝癌细胞系更有效的HAV 3C^pro抑制剂。特别是，研究人员显示KCN-A-12抑制HAV复制，并被预测可抑制蛋白酶活性。针对HAV 3C^pro的计算机筛选可用于抗HAV药物的进一步发现。