《International Journal of Nanomedicine》：Engineering Small Extracellular Vesicles for Colon-Targeted Delivery: Microenvironment-Responsive Design, Therapeutic Mechanisms, and Clinical Translation
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小型细胞外囊泡（sEVs）是内源性脂质双层纳米囊泡，兼具货物保护、生物膜相容性和可修饰的表面识别能力。在结肠靶向递送中，其价值取决于能否通过工程化改造以耐受胃酸和蛋白水解、穿越黏液屏障，并对结肠特异性信号作出响应，包括远端胃肠道的pH谱、微生物群来源的酶、炎症
小型细胞外囊泡（sEVs）是内源性脂质双层纳米囊泡，兼具货物保护、生物膜相容性和可修饰的表面识别能力。在结肠靶向递送中，其价值取决于能否通过工程化改造以耐受胃酸和蛋白水解、穿越黏液屏障，并对结肠特异性信号作出响应，包括远端胃肠道的pH谱、微生物群来源的酶、炎症性活性氧（ROS）以及病变相关受体（如整合素、CD44和叶酸受体）。本综述批判性地比较了sEVs与传统结肠靶向药物递送系统（CTDDS），并系统总结了sEVs的生物发生、货物分选、分离、表征、外源性与内源性装载、表面工程化，以及被动、主动和刺激响应性靶向策略。研究进一步评估了sEVs在炎症性肠病（IBD）和结直肠癌（CRC）中的治疗应用，重点关注上皮屏障修复、免疫调节、巨噬细胞极化、细胞凋亡、肿瘤微环境重塑，以及肠易激综合征（IBS）等新兴肠道适应症。本文还讨论了近期临床试验、良好生产规范（GMP）要求、效价与释放规格、安全性评估及监管不确定性。研究提出了一种面向疾病和给药途径的决策框架，将货物特性、给药途径、靶细胞生物学、生产可行性和临床有意义的终点相衔接。尽管工程化sEVs仍处于研究阶段，尚无治疗产品获得完全监管批准，但微流控生产、器官芯片验证、人工智能辅助设计和图像引导精准递送的整合有望提高其可重复性和转化成熟度。
Overview of sEVs
sEVs的生物发生、分子组成与功能机制
小型细胞外囊泡（sEVs）是由细胞释放的异质性脂质双层颗粒。国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议，在未直接证实内体来源时，应根据物理特征、生化组成或实验来源对囊泡进行描述性命名。外泌体在多囊泡体内（MVBs）作为腔内囊泡生成，与质膜融合后释放；微囊泡主要通过质膜向外出芽产生；凋亡小体则在程序性细胞死亡过程中生成。由于常用分离方法无法完全区分这些群体，本综述在未明确生物发生机制时统一使用操作性术语“sEVs”。sEVs的生物发生和货物分选涉及依赖内体分选复合物（ESCRT）的机制、非ESCRT依赖的脂质途径、四跨膜蛋白、Rab GTP酶和SNARE蛋白。货物选择并非随机：RNA结合蛋白、序列基序、翻译后修饰、膜微结构域及供体细胞状态均影响蛋白质、脂质、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA和DNA片段的富集。sEVs膜富含胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺及CD9、CD63、CD81、Alix和TSG101等蛋白，但标志物丰度因来源和制备方法而异。受体细胞通过网格蛋白或小窝蛋白依赖性内吞、巨胞饮、吞噬、受体-配体结合或直接膜融合内化sEVs，随后内体逃逸或溶酶体加工决定货物能否到达胞质并保持功能。
sEV分离与纯化技术比较
治疗性sEVs的制备是多步骤过程而非单一分离步骤。简要流程包括：供体来源的选择与鉴定；受控的细胞或生物体液采集；去除细胞、碎片和大囊泡；通过超速离心、过滤、尺寸排阻色谱（SEC）、沉淀、免疫亲和或微流控进行富集；对颗粒数量、尺寸、形态、标志物、纯度和生物活性进行正交表征；货物装载或表面工程化；去除未掺入试剂；无菌制剂；稳定性测试。由于高回收率、高纯度、功能保持、通量和可扩展性难以同时实现，方法选择应与预期应用严格匹配。除分离方案外，储存缓冲液、温度、冻融暴露和样品浓度也是显著影响sEVs回收率和效价的关键变量。超速离心（100,000–150,000 g）仍是最广泛使用的批量富集方法，可处理较大样品体积，但耗时、需专用设备，高剪切力可能损伤囊泡，共沉淀的蛋白质聚集体限制纯度。尺寸排阻色谱条件温和、保持囊泡完整性，但无法完全去除相似尺寸的脂蛋白，且通量低、洗脱液稀释。聚合物沉淀操作简便快速，但纯度最低，残留聚合物干扰下游检测。免疫亲和捕获可实现高纯度、亚群选择性分离，适合诊断应用，但成本高、捕获容量有限、洗脱可能损失活性。微流控技术集成多种分离原理，可实现自动化、低消耗分离并保持生物活性，但处理通量仍低于超速离心或沉淀，放大面临工程挑战。
sEV表征关键技术
sEV表征需覆盖至少三个领域：颗粒浓度与尺寸、形态、生化身份。纳米颗粒跟踪分析（NTA）、可调电阻脉冲传感（TRPS）和动态光散射（DLS）常用于量化颗粒浓度和尺寸分布。透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和冷冻电镜可观察囊泡形态，但常规脱水制样产生的杯状轮廓应视为制备伪影而非天然形态。四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）和晚期内体相关蛋白（Tsg101、Alix）是常用阳性标志物，ISEV指南建议同时评估多种互补阳性标志物及来源适当的阴性或污染标志物。原子力显微镜（AFM）可在近生理条件下对单个sEVs进行无标记高分辨成像，提供三维形貌和纳米力学参数（杨氏模量、粘附力、形变），可基于生物物理特征区分亚群。纳米流式细胞术（NanoFCM）可在单颗粒水平检测小至40 nm的颗粒，同时量化尺寸、浓度和表面标志物，速率可达每分钟10,000颗粒，从仅1 μL样品即可获得统计稳健的数据。由于不同表征平台间存在固有差异，强烈建议将NanoFCM与至少一种正交方法整合以确保准确全面的sEVs分析。
工程化sEVs的药物装载策略
sEVs作为药物递送载体的关键优势在于其保护和运输小分子、蛋白质和核酸的能力。当前方法可分为分离后通过物理化学膜扰动装载和分离前通过工程化供体细胞在生物发生过程中包装货物两类。电穿孔通过高压电脉冲在脂质双层上瞬时产生亲水纳米孔，为带电分子提供扩散通道，对核酸装载尤其有效，部分研究报道siRNA装载效率超过30%。在结肠靶向应用中，研究人员采用电穿孔将CX5461装载入槐花来源的细胞外囊泡，装载效率达23%；在DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，这些工程化sEVs显著促进结肠组织巨噬细胞向抗炎M2表型极化并有效修复肠道屏障功能。超声处理和挤出依赖机械剪切力。超声通过瞬时空化扰动增加膜通透性；挤出迫使sEVs通过孔径更小的纳米孔膜，机械剪切和形变造成暂时性膜破坏后重新密封。在结直肠癌治疗研究中，通过超声将5-氟尿嘧啶装载入牛奶来源的sEVs，药物装载效率达37.65%。挤出法对大分子蛋白质的装载效率一般为20–40%，是简单共孵育法的2.45倍，但机械力可能改变sEVs尺寸或导致表面蛋白脱落。皂苷处理通过提取膜胆固醇增加脂质双层流动性，可将过氧化氢酶装载效率从4.9%±0.5%提升至18.5%±1.3%，但需严格去除残留皂苷以防细胞毒性。冻融循环通过反复冰晶形成和融化机械破坏并重组膜结构，可用于构建sEVs-纳米脂质体杂合体。基因工程方法通过在供体细胞中基因修饰使治疗性货物在sEVs生物发生过程中自然分选进入囊泡，最大程度保留sEVs天然结构和生物活性。融合蛋白策略将目标蛋白与高丰度外泌体膜蛋白（如Lamp2b、CD9、CD63、CD81）融合表达。核酸结合蛋白介导的装载将RNA结合蛋白（如HuR、MS2外壳蛋白）与外泌体膜蛋白融合，同时在靶RNA中引入相应结合基序。光诱导蛋白-蛋白相互作用技术（EXPLORs）利用光敏蛋白CRY2和CIBN在蓝光下的异源二聚化实现特定时间点靶蛋白的可控招募。
工程化sEVs的结肠靶向策略
结肠特异性靶向可视为四步序列：保护sEVs免受胃酸、消化酶和小肠过早释放；利用远端胃肠道pH或微生物群来源酶触发区域暴露；通过受控黏附或黏液穿透增加与病变黏膜的接触；利用炎症信号或细胞表面受体增加病变选择性识别或激活。pH响应递送是最成熟的被动策略之一，但胃肠道pH是动态且疾病依赖性的。一种策略是将sEVs封装于pH响应聚合物基质中，如将间充质基质细胞来源的sEVs掺入海藻酸微球、明胶包被并用Eudragit FS 30 D保护以限制上消化道释放。另一种方法采用层层涂覆pH敏感聚合物，如将人胎盘间充质干细胞来源的sEVs用N-(2-羟丙基)-3-三甲基壳聚糖氯化物（HTCC）和氧化魔芋葡甘聚糖（OKGM）涂覆，在炎症结肠的微碱性pH下触发涂层解离和sEVs释放。酶响应被动靶向利用结肠微生物群提供的多种酶活性，包括糖苷酶、多糖酶、偶氮还原酶和硝基还原酶。果胶可抵抗人胃和小肠消化但可被微生物来源果胶酶裂解，果胶-钙水凝胶用于sEVs封装时，在含酶模拟结肠液中释放量比无酶培养基高约70%。时间依赖系统利用包衣水合、溶胀、溶蚀或破裂产生的程序化滞后相延迟释放，但胃排空和小肠转运时间个体差异大，应作为次级保障与pH、微生物酶、黏液特性或炎症信号响应元素组合使用。pH/酶双响应平台结合独立触发机制以提高释放可靠性，如功能化壳聚糖/HP-β-环糊精水凝胶结合pH和酶敏感元件用于植物来源纳米囊泡和山奈酚的两阶段口服递送。黏液相互作用方面，黏附性阳离子或多糖涂层可通过静电和氢键相互作用增加滞留时间，而亲水或近中性表面可减少非特异性黏蛋白结合并促进向上皮穿透。炎症响应区域靶向利用炎症结肠病变中较高的氧化应激、基质金属蛋白酶活性和破坏的上皮屏障，通过掺入ROS可裂解材料、MMP可裂解连接子或炎症响应表面元件实现病变黏膜内优先释放。
主动靶向策略的核心是赋予sEVs识别病变细胞特异性标志物的能力。基因工程方法中，Lamp2b支架系统应用最广泛，其N端位于外泌体膜外可作为外源配体融合展示位点。在结肠靶向领域，研究人员在sEVs表面展示精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽，特异性识别结肠癌细胞和肿瘤新生血管内皮细胞高表达的整合素αvβ3/αvβ5，RGD工程化sEVs共递送miR-21抑制剂和5-氟尿嘧啶显著增强结肠癌治疗效果。抗A33抗体工程化sEVs可实现阿霉素对过表达A33抗原的结直肠癌细胞的特异性递送。化学修饰方法中，DSPE-PEG脂质锚定系统利用FDA批准的药用辅料DSPE的疏水双链自发插入外泌体脂质双层，亲水PEG链末端连接靶向分子。胆固醇锚定RNA纳米结构将膜锚定胆固醇置于三向连接RNA构建体尾部促进插入囊泡膜，同时在外表面暴露叶酸或RNA适配体，叶酸展示的装载survivin siRNA的sEVs在患者来源结直肠癌异种移植模型中抑制肿瘤生长。DBCO点击化学平台通过应变促进叠氮-炔环加成在生理条件下无铜催化偶联，可用于将结肠癌特异性适配体（如AS1411和EpCAM适配体）可控偶联至sEVs表面。代谢糖工程与DBCO点击化学串联策略通过向供体细胞培养体系添加四乙酰化N-叠氮乙酰-D-甘露糖胺，使细胞在代谢过程中将叠氮基团整合入表面糖蛋白聚糖链，随后通过DBCO点击化学将荧光染料或靶向配体偶联至分泌的sEVs表面。化学生物学介导的程序化锚定整合不同技术优势。分选酶A介导的位点特异性连接识别LPXTG基序并与寡甘氨酸（GGG）形成酰胺键，研究人员将携带二甘氨酸的NH2-GG-PEG2000-DSPE分子通过DSPE疏水锚定插入外泌体膜，随后分选酶A将携带LPETG基序的EGFR纳米抗体7D12共价连接至膜上GG基团，实现纳米抗体在sEVs表面的位点特异性展示，7D12功能化sEVs特异性杀伤EGFR过表达肿瘤细胞而对EGFR阴性细胞毒性显著降低。
工程化sEVs与肠道微生物群的双向相互作用
肠道微生物群既是靶向变量也是潜在治疗介质。微生物群来源酶可激活果胶、葡聚糖、偶氮或多糖载体，但抗生素暴露、饮食、炎症和个体间菌群失调可改变释放时机和完整性。反之，植物、食品、哺乳动物或微生物来源囊泡可能改变细菌丰度、代谢物产生、上皮信号传导和黏膜免疫。微生物膜囊泡通过携带蛋白质、脂质、核酸和微生物相关分子模式穿过黏液和上皮屏障参与宿主-微生物群通讯，根据微生物来源和剂量，可能支持屏障稳态、促进免疫教育或放大炎症和促肿瘤信号。工程化sEVs开发应测量微生物群依赖性变异而非仅将微生物群视为释放开关，建议进行抗生素或无菌动物对照、纵向宏基因组学和代谢组学、粪便移植或定义菌群实验，并评估制剂本身如何改变微生物生态。
工程化sEVs的响应性释放策略
结肠环境提供多种内源信号用于响应性释放，包括pH、微生物群来源酶、活性氧、基质金属蛋白酶和疾病相关代谢变化。炎症性肠病和结直肠癌均以病变微环境中活性氧水平显著升高为特征。一种策略是直接将ROS清除剂装载入sEVs，如调节性T细胞来源sEVs装载氧化铈纳米颗粒作为双功能抗氧化和抗炎制剂，氧化铈纳米颗粒通过在Ce3+和Ce4+氧化态间循环的自催化氧化还原活性清除ROS，在TNF-α刺激细胞模型和DSS诱导小鼠结肠炎模型中有效降低肠上皮细胞ROS水平、维持肠道屏障完整性。双响应和多响应系统整合两种或更多触发机制。ROS/酶双响应口服递送系统由两个层级组件构成：甲氧基聚乙二醇和美沙拉嗪通过氧化条件下可裂解的硫醚键连接的ROS响应前药胶束；封装姜黄素负载前药胶束的魔芋葡甘聚糖（KGM）微球，可被结肠β-甘露聚糖酶特异性降解。口服后KGM壳首先被结肠β-甘露聚糖酶降解释放前药胶束，随后高ROS肿瘤微环境触发硫醚键裂解和位点特异性药物释放，在AOM/DSS诱导的CRC小鼠中显著提高存活率、抑制肿瘤生长、降低炎症细胞因子表达并恢复近乎正常的肠道微生物群组成。酶可裂解活化智能递送系统使用酶可裂解连接子将治疗或靶向部分拴系至sEVs表面。研究人员通过可被炎症病变中显著上调的基质金属蛋白酶特异性裂解的肽连接子将合成线粒体靶向肽SS-31修饰至sEVs表面，工程化sEVs归巢至炎症肠组织后，升高的MMP活性裂解肽连接子释放SS-31肽实现线粒体靶向功能，精确清除炎症肠道区域过量线粒体ROS、预防PANoptosis并恢复肠道屏障完整性。
治疗机制与疾病特异性应用
在IBD模型中，治疗性sEVs通过多个相互关联机制发挥作用。在肠上皮层面，sEVs摄取增强紧密连接和黏附连接蛋白表达、刺激黏蛋白产生、减少上皮凋亡和PANoptosis、促进伤口愈合和屏障修复。在免疫组分层面，sEVs货物抑制NF-κB及相关促炎通路、降低TNF-α、IL-1β和IL-6水平、促进巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型极化、重新平衡Th17/Treg轴。此外，抗氧化货物可减轻线粒体和胞质氧化应激。然而这些机制不应在不同sEVs制备物间泛化：其活性关键依赖于供体细胞来源、货物组成、剂量、给药途径和疾病阶段，急性小鼠结肠炎模型中观察到的抗炎效应本身不能预测人类患者的持久黏膜愈合。在CRC中，工程化sEVs用于增加化疗药物、小干扰RNA、microRNA调节剂和蛋白质的瘤内递送，提出的效应包括诱导凋亡、逆转耐药、抑制增殖和上皮-间质转化、抑制血管生成、巨噬细胞或树突状细胞重编程以及增强抗肿瘤T细胞应答。
