《Plants》：Unraveling the Genetic Basis of Cold Tolerance in Peanut (Arachis hypogaea L.) via QTL Mapping and Identification of Ahcold18 as a Candidate RWP-RK Transcription Factor
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花生（Arachis hypogaea L.）是全球重要的油料和经济作物。然而，频繁的冷胁迫严重损害其产量稳定性。为应对这一挑战，研究人员利用由耐冷地方品种Silihong与冷敏感品种Jinonghei 3衍生的重组自交系（recombinant inbred
花生（Arachis hypogaea L.）是全球重要的油料和经济作物。然而，频繁的冷胁迫严重损害其产量稳定性。为应对这一挑战，研究人员利用由耐冷地方品种Silihong与冷敏感品种Jinonghei 3衍生的重组自交系（recombinant inbred line，RIL）群体，在四个不同环境中对两个耐冷相关性状，即相对出苗率（relative emergence rate，RER）和相对出苗指数（relative emergence index，REI），进行了数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）定位。检测到两个与耐冷性相关的核心QTL，包括在所有环境中稳定表达的qRER6（表型变异解释率（phenotypic variation explained，PVE）为4.91%–5.15%）以及位于18号染色体上的共定位QTL qRER18.1/qREI18.2，该位点同时控制两个目标性状，PVE分别为14.56%–14.71%和10.34%。通过QTL定位与加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）的整合分析，Arahy.657RUG被鉴定为候选耐冷基因，并命名为Ahcold18。差异表达分析和在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中于冷冻胁迫（?9 °C）下的异源过表达实验表明，Ahcold18能够提高植物在低温胁迫下的存活率，提示其在耐冷性中具有普遍作用，值得在花生 chilling tolerance 背景下进一步研究。基于Ahcold18内部的变异位点开发了基因型KASP标记（KASP-2374669），该标记在RIL群体中与RER和REI表现出初步关联；然而，其用于标记辅助选择的实用性仍需在不同种质中进一步验证。本研究为栽培花生耐冷性的标记辅助育种提供了关键的遗传资源和精准的技术工具。
论文解读：花生耐冷性遗传基础的解析及候选基因Ahcold18的鉴定
一、研究背景与意义
花生是全球重要的油料和经济作物，在植物油供应和农业经济发展中具有重要地位。然而，全球气候变化导致低温等极端天气事件日益频繁，周期性低温胁迫平均每三至四年发生一次，可造成13%–15%的作物产量损失。花生是喜温作物，种子萌发最低温度为12–15 °C，低温胁迫严重抑制萌发和早期生长，尤其在东北冷凉产区，冷害成为限制花生产业发展的主要瓶颈。解析花生耐冷性的遗传基础与分子调控机制，对培育耐冷品种和保障生产稳定性具有重要意义。
目前，花生耐冷性研究相对匮乏，大多局限于单一方法，缺乏将QTL定位、转录组分析和基因功能验证相结合的系统研究。为此，研究人员以耐冷地方品种Silihong和冷敏感品种Jinonghei 3衍生的重组自交系（RIL）群体为材料，综合运用QTL定位、WGCNA、异源过表达验证和KASP标记开发等手段，系统解析花生萌发期耐冷性的遗传基础。
二、主要研究技术与方法
研究人员利用由Silihong（母本，耐冷地方品种）与Jinonghei 3（父本，冷敏感品种）杂交经单粒传法构建的248个F
13代RIL家系，在2021—2022年保定（河北）和阜新（辽宁）两个生态点设置早播（约10 °C）和正常播（约15 °C）两种播期，构成四个环境（E1–E4），测定相对出苗率（RER）和相对出苗指数（REI）。基于重测序构建的高密度遗传图谱（含4499个SNP标记），采用基于混合模型的复合区间作图（MCIM）法进行QTL定位。同时，对两亲本在10 °C低温处理和15 °C对照下的种子胚进行转录组测序（42个样本），通过WGCNA构建共表达网络。对候选基因在拟南芥中进行异源过表达功能验证，并基于基因内部变异位点开发KASP标记，在RIL群体中选取的极端家系中验证其与耐冷性状的关联。
三、主要研究结果
1. 表型变异与遗传分析
四个环境中，Silihong的RER为63.16%–97.14%，Jinonghei 3为18.75%–45.46%；REI方面，Silihong为60.28%–83.19%，Jinonghei 3为26.29%–58.74%。RIL群体中RER变幅0–96%，REI变幅0–100%，均呈连续正态分布。方差分析表明，基因型、环境及基因型×环境互作对两性状均有极显著影响（p < 0.001）。RER和REI的广义遗传力分别为89.10%和68.29%，表明两性状主要受遗传控制，但环境互作显著，需要多环境鉴定。
2. QTL定位
共检测到7个与萌发期耐冷性相关的QTL，分布于6、16和18号染色体，物理区间552.08–763.40 kb，LOD值2.79–7.68，PVE 4.91%–14.71%，加性效应1.49–7.00。其中，qRER6在四个环境中均稳定检出，PVE为4.91%–5.15%；18号染色体标记区间3611–3612内存在共定位区域qRER18.1/qREI18.2，同时控制RER（E1–E3，PVE 14.56%–14.71%）和REI（E3，PVE 10.34%），且加性效应方向一致，Silihong等位基因均增加性状值，提示存在共同调控因子或多效性位点。
3. WGCNA与候选基因鉴定
利用42个转录组样本，筛选33,489个高质量表达基因（FPKM > 1），以软阈值β = 12构建共表达网络，动态树切法鉴定出9个模块。依据与冷处理显著正相关（FDR < 0.05）、模块成员度（MM）> 0.8以及富集胁迫响应GO条目等标准，确定MEGreen和MEBrown为核心冷响应模块。两者均与Silihong冷处理显著正相关（r = 0.378，p < 0.05），且富集“胁迫响应”、“冷驯化”和“脂质代谢”等GO条目。将模块与QTL区间整合分析发现，MEBrown中有15个基因与qRER18.1重叠，其中8个存在亲本间序列多态性。仅Arahy.657RUG在冷处理后1、2、3天均持续显著差异表达（差异倍数3.2×、4.5×、5.1×，FDR < 0.01），其MM值为0.91，基因显著度（GS）为0.83。qRT-PCR验证其在Silihong中表达显著高于Jinonghei 3。序列和结构域分析表明，Arahy.657RUG编码RWP-RK转录因子，是拟南芥NLP8（AT2G43500）的直系同源物，包含GAF-NLP和RWP-RK结构域，命名为Ahcold18。
4. 功能验证
构建35S::Ahcold18过表达载体转化拟南芥，获得三个T3纯合转基因株系。在?9 °C处理3小时后恢复10天，野生型平均存活率仅12.50%，而三个转基因株系存活率均显著高于野生型（p < 0.01），表明Ahcold18可增强植物低温耐受性。但由于异源系统与胁迫方式（花生为约10 °C chilling，拟南芥为?9 °C freezing）的差异，该结果支持Ahcold18参与冷胁迫响应，仍需在花生中通过互补或基因编辑等验证其因果性。
5. 基因型KASP标记开发
在Ahcold18内部鉴定出1个SNP（Chr.18:2374669，A/C）和2个InDel，基于SNP位点开发KASP-2374669标记。利用RIL群体中按RER极端值选取的60个家系（23个耐冷、37个冷敏感）进行基因分型，成功率达98.3%，检测到AA和CC两种纯合基因型，无杂合个体。AA基因型在耐冷家系中占82.6%，CC基因型在冷敏感家系中占81.1%。在四个环境中，AA基因型家系的RER和REI均显著高于CC基因型（p < 0.01，FDR < 0.05）。然而，该验证与QTL发现使用同一群体，可能因群体结构和连锁不平衡导致效应高估，标记在多样种质中的实用性尚需独立验证。
四、讨论与结论
该研究通过多环境QTL定位鉴定到稳定的共定位位点qRER18.1/qREI18.2，该位点同时影响出苗速率和整齐度，可能具有多效性，为通过单一遗传靶标同步改良多个耐冷性状提供了可能。Ahcold18属于植物特有的RWP-RK转录因子家族，以往研究多集中于氮代谢和生殖发育，其在冷适应中的潜在调控作用拓展了该家族的生物学功能。研究者指出，仍需通过精细定位、花生中的互补实验或CRISPR/Cas9基因编辑等手段，才能确立Ahcold18自然变异与QTL效应的因果关系。此外，KASP-2374669标记虽然在RIL极端家系中与耐冷性状显著关联，但需在多样化的自然群体、育种品系中验证其预测能力和选择效率，方可推荐用于标记辅助选择。
综上，本研究通过QTL定位与WGCNA的整合分析，克隆到候选耐冷基因Ahcold18（编码RWP-RK转录因子），并通过异源过表达验证了其低温耐受功能；同时开发了基于基因变异的KASP标记，为花生耐冷性标记辅助育种提供了基因资源和精准技术工具，加深了对花生萌发期冷适应分子机制的理解。
