维生素A修饰的小檗碱脂质体通过增强肝星状细胞摄取增强抗纤维化作用

《International Journal of Nanomedicine》：Vitamin A-Modified Berberine Liposomes Potentiate Anti-Fibrotic Effects Through Enhanced Hepatic Stellate Cell Uptake

　　

背景：激活的肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）是肝纤维化的关键驱动因素，若没有有效干预，肝纤维化会不可逆地进展。天然生物碱小檗碱（berberine, BBR）据报道具有抗纤维化活性。然而，游离BBR的溶解性差和注射相关的全身毒性限制了其只能口服给药，导致其生物利用度低。纳米载体封装可以解决这些缺点，因此研究人员旨在开发一种优先靶向HSC的递送系统，负载BBR以提高其抗纤维化效果而不引起全身毒性。

方法：本研究合成了维生素A（vitamin A, VA）修饰的脂质，构建优先靶向HSC的脂质体以封装BBR并提高递送效率。对该靶向BBR脂质体系统进行了理化表征，随后进行了细胞摄取和抑制HSC活化的体外评估。进行了体内动物研究以验证靶向BBR脂质体对肝纤维化的治疗效果。

结果：VA修饰的BBR脂质体平均大小为165.9 ± 7.1 nm，具有所需的尺寸分布。与非靶向BBR脂质体相比，VA修饰的脂质体BBR显著增加了HSC摄取，从而表明通过显著降低HSC迁移和增殖能力以及体外降低胶原蛋白1表达，增强了抑制HSC活化的作用。有趣的是，与早期文献相反，研究人员检测到BBR处理后α-SMA表达升高，尽管细胞迁移、增殖和胶原产生受到抑制。在肝纤维化小鼠模型中，5 mg/kg的靶向BBR脂质体显著降低了血清中的天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）和丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）水平，并显著减少了纤维化区域和胶原合成与沉积，而同等剂量的非靶向BBR脂质体则效果可忽略不计。

结论：研究结果表明，VA功能化脂质体促进了BBR在肝纤维化中向活化HSC的高效靶向递送。这种靶向递送增强了游离BBR固有的抗纤维化效力，突出了这种纳米平台在肝纤维化治疗中的潜力。

肝纤维化是慢性肝损伤反复愈合导致的病理过程，其核心驱动因素是肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）激活并转分化为肌成纤维细胞，进而过度产生和沉积细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分，如胶原。目前临床治疗策略主要针对病因控制，如抗病毒、戒酒等，但缺乏直接抑制HSC激活或逆转纤维化的药物，且现有疗法存在依从性差、耐药及晚期疗效有限等问题。天然生物碱小檗碱（berberine, BBR）具有抗肝纤维化活性，但水溶性差、化学稳定性低，且游离BBR注射给药存在急性心脏毒性风险，导致其只能口服，生物利用度低。纳米载体如脂质体可改善这些缺陷，但常规脂质体在肝脏中主要被Kupffer细胞和肝窦内皮细胞摄取，难以靶向HSC。维生素A（vitamin A, VA）具有天然的HSC靶向特性，活化HSC高表达视黄醇结合蛋白4受体STRA6，因此VA修饰的纳米载体可实现HSC特异性递送。基于此，研究人员开发了VA修饰的BBR脂质体，以增强HSC摄取、提高抗纤维化效果并降低全身毒性。

研究人员合成了DSPE-VA脂质，采用薄膜水化结合热挤出法制备负载BBR的VA修饰脂质体，并利用动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行表征。体外实验中，通过DiI荧光标记评估脂质体靶向摄取，采用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移，CCK-8和细胞周期分析评估增殖，qPCR和Western blot检测基因和蛋白表达，并开展胶原凝胶收缩实验。体内研究采用CCl₄腹腔注射诱导C57BL/6J小鼠肝纤维化模型，尾静脉注射不同脂质体制剂（BBR等效剂量5 mg/kg），通过血清ALT/AST检测、HE、Sirius Red、Masson染色和免疫荧光评估疗效。小鼠购自GemPharmatech，HSC细胞系来自上海细胞库。

**VA修饰脂质体的制备与表征**：FTIR证实DSPE-VA偶联物合成成功，脂质体粒径为171.1 ± 4.9 nm，zeta电位为1.8 ± 0.7 mV，形态均匀，90天内粒径稳定。

**VA修饰脂质体被HSC摄取**：DiI标记的VA修饰脂质体在静息和TGFβ激活的HSC中均显著高于未修饰脂质体，活化HSC摄取更高，与STRA6表达上调一致。

**BBR负载的VA修饰脂质体的表征**：VA修饰BBR脂质体粒径为165.9 ± 7.1 nm，包封率约11.8%，释放缓慢，4°C储存45天无明显渗漏。BBR提取定量显示，VA修饰组细胞摄取量较非靶向组提高约3.5倍。

**VA修饰脂质体BBR在活化HSC中的体外治疗效果**：qPCR显示VA修饰BBR脂质体显著降低Col1α1基因表达，但α-SMA表达反而升高，Western blot结果一致。划痕实验和Transwell实验表明迁移能力明显下降；CCK-8显示细胞生长减慢，细胞周期分析显示S和G2/M期阻滞，提示增殖抑制。胶原收缩实验（游离BBR处理）显示，尽管α-SMA上调，但细胞收缩能力降低。

**VA修饰脂质体BBR的体内治疗评估**：在CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型中，VA修饰BBR脂质体显著降低血清ALT和AST水平，而等剂量非靶向脂质体无显著效果。HE染色显示靶向治疗组肝细胞脂肪变性和水样变性明显减轻；Sirius Red和Masson染色显示纤维化面积显著减少，免疫荧光显示胶原I表达显著下降，α-SMA有轻微但无统计学差异的降低。心、脾、肺、肾HE染色未见损伤，小鼠体重无明显变化，表明安全性良好。

讨论部分指出，HSC活化是肝纤维化的核心病理环节，但常规药物和纳米载体难以有效靶向HSC。VA修饰通过受体介导机制增强HSC摄取，本研究还发现BBR上调α-SMA却抑制迁移、增殖和收缩，可能与细胞模型差异及应力纤维破坏有关。VA修饰脂质体在低剂量下仍能发挥明显抗纤维化作用，优于非靶向制剂。局限性包括未详尽比较多种肝细胞摄取、短期模型不能完全模拟人类疾病、长期安全性需进一步评估，以及α-SMA上调机制尚待阐明。

总之，本研究成功构建了VA修饰的BBR脂质体，增强了BBR向HSC的靶向递送，抑制了HSC迁移、增殖和胶原合成，减少了游离BBR的全身毒性，为肝纤维化治疗提供了有前景的纳米递送平台。