《Plants》：Systematic Evaluation of Mesophyll Protoplast Isolation and PEG-Mediated Transient Expression in Rosa chinensis ‘Old Blush’
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月季稳定转化慢且依赖基因型，这促使研究人员建立快速的细胞学检测体系用于候选基因测试。研究人员系统评价了月季（Rosa chinensis）‘Old Blush’中叶肉原生质体分离及聚乙二醇（PEG）介导的瞬时表达。序贯实验比较了酶制剂、消化时间、D-甘露醇浓度
月季稳定转化慢且依赖基因型，这促使研究人员建立快速的细胞学检测体系用于候选基因测试。研究人员系统评价了月季（Rosa chinensis）‘Old Blush’中叶肉原生质体分离及聚乙二醇（PEG）介导的瞬时表达。序贯实验比较了酶制剂、消化时间、D-甘露醇浓度、栽培品种及供体培养方式。在所测试条件下，含3.0% Cellulase R-10与2.0% Macerozyme R-10的Yakult制剂、16 h消化、0.4 mol/L D-甘露醇可获得4.641 ± 0.102 × 106 个原生质体/g鲜重，FDA活力为94.26 ± 0.15%。不同供体培养方式及两个测试栽培品种间回收率差异显著。在一个含3株植株作为区组的27组合因子实验中，25% PEG 4000工作液（12.5%标称终浓度）、8 min转染、20 h暗培养获得最高观测mGFP6阳性比例（7.14 ± 0.22%）。该效率可支持在所测条件下对单个转染细胞成像，但群体水平或高通量应用仍需进一步验证。研究人员未评估原生质体分裂、植株再生、稳定转化、跨日期重复性及其他基因型转移。
研究背景方面，月季（Rosa chinensis）是重要观赏作物及研究反复开花、花器官发育、香气与色素代谢、胁迫响应和驯化性状的多年生木本系统。‘Old Blush’已有染色体水平基因组，可支撑候选基因和调控位点发现，但稳定转化依赖基因型响应的再生、长期组培和转化植株恢复，作为每个候选基因的初筛手段效率很低。已有蔷薇属研究建立了叶肉原生质体分离、培养及由胚性细胞来源原生质体再生植株，但这些体系受组织和基因型限制，常需胚性培养或长周期再生，并且没有在叶肉原生质体中系统比较酶制剂来源、供体培养方式和完整因子设计的聚乙二醇（PEG）瞬时表达。因此，研究人员开展一项边界明确的评价，为‘Old Blush’建立叶肉原生质体分离与瞬时表达的可选操作条件。
该论文发表在《Plants》。
主要关键技术方法方面，研究人员以田间生长植株、离体组培苗和温室扦插苗作为供体培养方式来源，并以‘Old Blush’和‘Blue Rhapsody’作为栽培品种比较来源；采用序贯实验优化酶制剂来源与浓度、消化时间和D-甘露醇渗透压，再以三因素三水平全因子设计评价PEG 4000工作液浓度、转染时间和暗培养时间对瞬时表达的影响；以 fluorescein diacetate（FDA，荧光素二乙酸酯）染色评估活力，以 confocal laser-scanning microscope（CLSM，共聚焦激光扫描显微镜）检测mGFP6报告信号，并以植物个体作为生物学重复和区组进行统计分析。
研究结果方面，3.1 酶制剂来源与浓度对原生质体回收的影响。研究人员比较Yakult与Coolaber两种Cellulase R-10和Macerozyme R-10制剂，发现制剂来源对产量和活力影响极显著；Yakult制剂在3.0% Cellulase R-10、2.0% Macerozyme R-10时获得最高产量4.641 × 106 个/g鲜重，活力94.26%；Coolaber制剂最高产量约为其1/5.9且高酶浓度下活力下降明显。结论为酶制剂来源不可忽略，后续实验选用Yakult制剂。
3.2 消化时间对原生质体产量和活力的影响。研究人员设6至24 h消化处理，发现产量和活力在16 h最高，之后下降；6 h可能释放不完全，24 h则损伤增加。结论为标准流程选用16 h消化。
3.3 D-甘露醇浓度对渗透响应的影响。研究人员测试0.3至0.8 mol/L D-甘露醇，0.4 mol/L产量最高，0.5 mol/L活力最高且与0.4 mol/L无显著差异；低浓度导致胀破和碎屑，高浓度导致收缩和形态不规则。结论为选用0.4 mol/L以兼顾产量、活力和形态。
3.4 栽培品种对原生质体产量和活力的影响。研究人员将9种酶浓度组合用于‘Old Blush’和‘Blue Rhapsody’，‘Old Blush’产量更高，‘Blue Rhapsody’边际活力更高；两者最高产量均出现在3.0% Cellulase R-10、2.0% Macerozyme R-10，但后者最高产量仅为前者的67.2%。结论为高产基因型不等于高活力基因型，新增栽培品种需重新优化。
3.5 供体栽培方式对原生质体分离的影响。研究人员比较田间、离体和温室材料，田间叶片回收率最低，离体与温室材料较高且选定配方下接近；田间回收低并非释放细胞普遍失活，而是释放量少。结论为温室扦插苗兼具高回收、易扩繁和可重复取嫩叶的优势，用于常规转染。
3.6 全因子分析确定最高表现的PEG条件。研究人员以PEG 4000工作液浓度、转染时间和暗培养时间做27组合实验，效率范围为0.63%至7.14%；25% PEG 4000工作液、8 min转染、20 h暗培养获得最高mGFP6阳性比例7.14 ± 0.22%。三因素方差分析显示PEG浓度、转染时间和暗培养时间主效应均显著，PEG浓度与转染时间存在显著交互，植株区组也显著。结论为该条件是测试设计中观测到的最优条件，而非普适最优。
3.7 FDA阳性原生质体场计数与报告表达。研究人员统计转染后每视野FDA阳性细胞数，其受悬液密度和视野选择影响，不是生存率；27个处理均值上，FDA阳性计数与mGFP6阳性比例的相关接近零。结论为不能据此断言生存与表达存在权衡，也不能推导膜透化机制。
讨论部分总结方面，研究人员指出特定酶制剂来源造成约5.9倍产量差异，但未测定活性、辅料、批次等生化原因；Cellulase R-10与Macerozyme R-10不能独立解释，酶矩阵存在交互。消化时间和渗透压形成窄操作区间，供体生理状态显著影响木本植物原生质体表现。基因型比较说明‘Old Blush’高产、‘Blue Rhapsody’高边际活力，条件不能跨品种直接迁移。PEG结果呈非线性，25% PEG 4000、8 min、20 h暗培养可成像单个阳性细胞，但远低于群体生化或高通量筛选常用效率。FDA计数与表达无相关，不代表已证实生存—表达权衡或机制。研究局限包括单基因型、单报告基因、单日期、未测跨实验室重复、未做分裂再生稳定转化及基因组编辑评价。
结论部分翻译方面，对于月季（Rosa chinensis）‘Old Blush’，经0.4 mol/L D-甘露醇、3.0% Cellulase R-10、2.0% Macerozyme R-10消化16 h的温室嫩叶为选定分离条件。在27处理因子网格中，25% PEG 4000工作液（12.5%标称终浓度）作用8 min后暗培养20 h获得最高观测表达，即7.14 ± 0.22% mGFP6阳性原生质体。本研究为所测条件下‘Old Blush’的PEG介导瞬时表达和单个阳性原生质体成像提供了有用起始方案，但未确立可转移性、独立日期重复性、群体水平应用、原生质体分裂、植株再生或稳定转化。
