《Applied and Environmental Microbiology》：Moderate expression and activity of flocculins underlie the characteristic flocculation phenotype of Saccharomyces pastorianus
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絮凝是拉格啤酒酿造中的一个关键工艺性状，决定着发酵性能、酵母回收和啤酒品质。在异源非整倍体杂交酵母巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）中，由于其复杂的双亚基因组结构，絮凝的遗传基础至今仍未得到很好的解析。本研究对Group II菌株
絮凝是拉格啤酒酿造中的一个关键工艺性状，决定着发酵性能、酵母回收和啤酒品质。在异源非整倍体杂交酵母巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）中，由于其复杂的双亚基因组结构，絮凝的遗传基础至今仍未得到很好的解析。本研究对Group II菌株CBS 1483的完整FLO基因 repertoire进行了系统的重新注释和功能表征。共鉴定出13个FLO基因，包括等位基因变体和一个此前未被表征的黏附素Flo12，后者含有Hyphal_reg_CWP结构域而非典型的PA14凝集素结合结构域。结构建模揭示了PA14结构域中Ca2?结合残基的高度保守性，同时重复区段的多样化可能导致了功能差异性。通过在FLO缺失背景中采用光遗传学表达，研究人员证明了SpcI-FLO9-1和SpcI-FLO9-2_1是絮凝最强的驱动因子，并表现出NewFlo样糖敏感性。在17°P麦汁发酵过程中的转录组分析显示，这些基因的动态诱导与絮凝起始相吻合。出乎意料的是，在CBS 1483中删除这两个基因座并未消除絮凝，而只是延迟了麦汁中的沉降，同时伴随麦芽糖利用率和发酵度的改善。这些发现揭示了拉格酵母FLO网络内部的功能冗余和补偿机制，凸显了絮凝背后的遗传复杂性，并为指导酵母筛选、菌株开发和拉格啤酒发酵工艺优化提供了分子框架。
**论文解读：巴斯德酵母絮凝素中等表达与活性构成拉格酵母特征性絮凝表型的分子机制**
**一、研究背景与科学问题**
絮凝是指酵母细胞以可逆、非有性方式并在Ca2?依赖条件下聚集成多细胞团簇的生理过程，是酿造酵母的一项核心工艺性状，直接决定啤酒发酵性能、产品澄清度与工艺效率。在拉格啤酒酿造中，底部发酵酵母在发酵末期及时且稳定地聚集沉降，对于实现可预测的发酵进程、高效的酵母回收以及拉格啤酒特有的清亮外观至关重要。絮凝过早会导致发酵度不足，尤其是麦芽三糖这一关键后期糖的残留，进而造成残余甜味偏高和酒精含量偏低，同时可能引起乙醛积累并减少赋予清爽拉格风味的后期高级醇和酯类；过早絮凝还会限制酵母将双乙酰还原为乙偶姻和2,3-丁二醇，产生奶油味异味。反之，絮凝过弱或延迟则会妨碍啤酒澄清和酵母采收，延长冷储澄清时间，增加储罐占用和下游加工成本，并可能因长时间悬浮导致酵母活力下降和自溶异味。因此，中等且可预测的絮凝动力学对于经典拉格风味特征至关重要。
在分子水平上，酵母絮凝主要由絮凝素（flocculins）介导——这是一类含凝集素样结构域的细胞壁锚定蛋白，在Ca2?存在下与邻近细胞糖基化细胞壁蛋白上的α-甘露聚糖的甘露糖残基结合，驱动细胞间黏附与聚集体形成。这些絮凝素由FLO黏附素基因家族编码。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，FLO1、FLO5、FLO9和FLO10负责细胞间黏附，而FLO11与假菌丝形成、侵入性生长和生物膜形成有关。然而，拉格酵母巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）的情况更为复杂：该物种是驯化酿酒酵母与耐冷野生种真贝酵母（Saccharomyces eubayanus）天然杂交形成的异源非整倍体种间杂交酵母，其双亚基因组结构和大规模染色体重排导致FLO基因的组成和功能高度复杂，不同菌株间存在显著差异。这一复杂的遗传背景使得拉格酵母絮凝的分子遗传基础长期未能得到清晰解析。
**二、研究目的与主要技术方法**
该研究旨在系统解析Group II拉格酵母菌株CBS 1483的完整FLO基因repertoire，阐明各絮凝素在絮凝表型中的功能贡献及其调控机制，从而为拉格酵母的菌株选育和发酵工艺优化提供分子框架。研究采用的主要关键技术包括：（1）基于基因组重注释和扩增子重测序对CBS 1483完整FLO基因集进行鉴定与校正；（2）利用AlphaFold 3对絮凝素蛋白进行结构建模与PA14结构域比对分析；（3）在敲除全部天然FLO基因的酿酒酵母平台菌株中，通过光遗传学（optogenetics）OptoQ-AMP5系统对各FLO基因进行精准诱导表达，系统评估其絮凝系数、絮团大小、糖抑制谱和细胞表面疏水性；（4）在17°P麦汁E.B.C. tall tube发酵中对CBS 1483进行转录组时间序列分析，监测FLO基因在发酵过程中的动态表达；（5）通过CRISPR-Cas9介导的基因敲除构建SpcI-FLO9-1和SpcI-FLO9-2双缺失菌株，并在标准麦汁发酵中验证其表型效应。
**三、研究结果**
**1. CBS 1483 FLO基因repertoire的组成**
对CBS 1483基因组的重新分析鉴定出11个推定的FLO基因座，经扩增子重测序校正了组装中的测序错误后，最终预测得到13个独特的FLO基因（含等位基因变体），其中9个编码全长蛋白，4个因提前终止密码子而推测无功能。新发现的Flo12含Hyphal_reg_CWP结构域而非典型PA14结构域，与白色念珠菌（Candida albicans）和光滑念珠菌（Candida glabrata）中的黏附素具有结构相似性。蛋白序列比对显示这些絮凝素可分为Flo1样、Flo10样、Flo12样和Flo11样四类。
**2. 絮凝素蛋白结构特征**
PA14结构域多重序列比对显示，Ca2?结合残基和碳水化合物识别关键残基高度保守；但Flo1亚结构域和L3环在CHRVI/CHRXII编码的絮凝素及ScI-Flo10中存在显著变异，可能影响配体识别特异性。AlphaFold 3结构预测确认了PA14结构域的典型β-三明治折叠，所有含PA14结构域的絮凝素均可结合甘露糖-α1,2-甘露糖-α1,2-甘露糖。重复区分析显示，S. eubayanus来源的Flo1样蛋白缺乏重复类型2和4，而SpcI-Flo9蛋白含有大量重复类型5，与酿酒酵母蛋白差异显著。Flo12的Hyphal_reg_CWP结构域被预测为右手β-螺旋加α-晶体样折叠，具有真菌黏附素的典型特征。
**3. 光遗传学功能评估**
在FLO缺失背景中，经2小时光诱导后，仅SpcI-FLO9-1和SpcI-FLO9-2_1表现出显著的絮凝系数增加（73.6% ± 8.8%和65.7% ± 12.6%）；延长诱导至24小时后，两者分别达到98.1%和94.6%，SpcI-FLO9-2_2和SpeVI-FLO12也表现出显著的絮凝活性（80.1%和57.9%）。所有FLO基因诱导产生的絮团尺寸均显著小于ScI-FLO1对照。糖抑制实验表明，SpcI-Flo9蛋白呈现NewFlo样糖敏感性谱，但没有任何单一絮凝素能重现CBS 1483对所有测试糖的强抑制模式。SpeVI-Flo12表现出不依赖Ca2?且对甘露糖中等敏感的絮凝行为。疏水性测定显示，SpeXII-Flo1-5、SpeVI-Flo10和SpeVI-Flo12能显著增加细胞表面疏水性（76.5%、55.0%和75.8%），但并不一定诱导宏观絮凝，表明表面疏水性与细胞聚集是两个不同的机制。
**4. 发酵过程中的FLO基因表达动态**
在17°P麦汁E.B.C. tall tube发酵中，CBS 1483在第5天开始絮凝，与主要可发酵糖的耗竭相吻合。转录组分析显示，FLO基因整体表达水平较低（rpkm值最高不超过38.5），但SpcI-FLO9-1和SpcI-FLO9-2_1在第6天相对第2天均表现出4.5倍的诱导上调，SpeI-FLO1-3和SpeXII-FLO1-5分别上调3.2倍和3.5倍。SpcI-FLO9-2_2的表达极低，表明存在等位基因偏向性表达。SpeVI-FLO10在第1天表达最高（38.5 rpkm），但与絮凝起始的相关性较弱。这些动态表达模式与絮凝起始高度吻合，提示多个絮凝素的协同诱导而非单一主效基因控制絮凝。
**5. 双基因敲除的功能验证**
构建SpcI-FLO9-1和SpcI-FLO9-2双敲除菌株IMX3185后，在17°P麦汁发酵中发现，敲除并未消除絮凝沉降，而仅将沉降延迟了约24–30小时。最终两株菌均在第10天基本完成沉降。值得注意的是，IMX3185表现出略好的发酵度，最终比重为4.25°P（对照为4.6°P），残余麦芽糖浓度更低（4.7 ± 0.4 g·L?1对比6.81 ± 0.5 g·L?1）。这表明FLO网络内部存在功能冗余和补偿机制，能够部分代偿主要絮凝素的缺失。
**四、讨论与结论**
该研究对传统“单一强效絮凝素主导”模型提出了挑战。研究结果表明，拉格酵母的絮凝表型并非由单个高活性絮凝素控制，而是由多个中等活性的黏附素以较低表达水平协同作用所涌现的网络性质。与ScI-Flo1相比，CBS 1483絮凝素的重复区数量显著较少（如SpcI-Flo9-1仅含6个I型重复，而ScI-Flo1含20个），这解释了其较低的固有结合强度，也暗示拉格酵母在驯化过程中可能选择了“最优”而非“最大”的絮凝能力。双基因敲除后絮凝并未消失的结果，与酵母中多个旁系同源基因家族的转录补偿范例（如PDC1/PDC5、HXK2/HXK1、ENO1/ENO2等）相一致，表明FLO网络的冗余结构为遗传扰动提供了缓冲。该研究还排除了Lg-FLO1在CBS 1483中的主导作用（该菌株缺乏功能性Lg-FLO1但仍展现NewFlo表型），并指出KALAR/KVLAR基序并非NewFlo型糖识别所必需。研究结论强调，拉格酵母絮凝是一个由中等表达和中等活性的黏附素网络所涌现的系统层面属性，补偿性相互作用保障了工业发酵中生物量去除与拉格发酵动力学的最佳匹配，这为通过调节而非最大化絮凝性能的理性菌株工程策略提供了分子框架。该论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。
