基于多重PCR的靶向NGS检测方法的开发及其在临床呼吸道标本中扩大病毒检测的初步分析评价

《Diagnostics》：Development and Initial Analytical Evaluation of a Multiplex PCR-Based Targeted NGS Assay for Expanded Viral Detection in Clinical Respiratory Specimens

　　

背景：感染性疾病的诊断目前主要依赖于聚合酶链反应（PCR）检测。然而，这些方法能够同时检测的病原体范围有限，且其有效使用依赖于先验的病因学假设。基于多重PCR的靶向下一代测序（mp-tNGS）被认为是扩展病毒检测的一种有前景的补充方法。本研究旨在开发一种自研mp-tNGS方法，对其分析灵敏度进行初步评价，并探索其在临床呼吸道标本中的性能。方法：该方法包含一个靶向28种病毒的引物组和用于mp-tNGS数据处理的生物信息学流程。使用含有包被RNA或DNA的阳性对照样本（PCSs）评价分析灵敏度。使用910份鼻咽和口咽拭子标本探索其临床性能，这些标本根据既往PCR检测结果分为三组。结果：在28个病毒靶标中，23个接受了实验性分析评价，而5个仅进行了计算机模拟评估。在测试的23个PCSs中，19个的估计检测限（LoD）范围为6.3 × 10²至9.4 × 10³拷贝/mL。在216份PCR阳性标本组中，139份的PCR和mp-tNGS结果完全一致；在28份标本中，mp-tNGS额外检测到其他病毒。在394份PCR阴性标本中，mp-tNGS在81份中检测到病毒。在300份医院来源标本组中，mp-tNGS在131份标本中检测到至少一种病毒靶标，包括初始检测未发现的额外病毒检出和共感染。额外发现中有相当比例涉及EB病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV），需要谨慎的临床解读。结论：所开发的mp-tNGS方法显示出同时检测多种已知病毒、提供病毒分型和识别共感染的潜力。该方法可作为辅助工具，拓宽呼吸道感染的实验室诊断；然而，仍需进一步优化、验证和标准化结果解读标准。

急性呼吸道感染（acute respiratory infections, ARIs）是重要的公共卫生问题，约80%的病例由病毒引起。当前病原学诊断主要依赖聚合酶链反应（PCR），但常规PCR的多重检测能力通常仅限于每反应约5个靶标，且必须依据先验的病因学假设选择检测项目，难以覆盖广泛病毒谱，也易漏检混合感染。基于多重PCR的靶向下一代测序（multiplex PCR-based targeted next-generation sequencing, mp-tNGS）通过多重引物对目标核酸进行富集，可在单次分析中检测数十至数百种已知病原，同时具有中等通量和成本优势，被认为是扩大病毒检测范围的有力补充工具。该研究发表于《Diagnostics》，旨在开发一种自研mp-tNGS方法，初步评估其分析灵敏度，并利用临床呼吸道标本探索其应用性能。

研究人员构建了靶向28种病毒（或亚型）的多重引物组，其中23个靶标通过阳性生物样本进行实验验证，另5个靶标因缺乏阳性样本仅进行计算机模拟评估。研究共分析910份鼻咽/口咽拭子标本，分为三组：I组（216份既往PCR阳性）、II组（394份既往PCR阴性）和III组（300份来自莫斯科儿童医院的住院患者标本）。主要关键技术包括：基于NCBI参考序列的引物设计（Primer-BLAST）并分为两个引物池以减少引物二聚体；总核酸提取与逆转录；双重多重PCR扩增（两池退火温度分别为58°C和60°C，优化MgCl₂浓度）；采用Nextera接头进行文库制备，并在Illumina MiSeq或Salus Pro平台测序；生物信息学分析采用两条独立流程（基于参考序列比对和基于BLASTn分类），并应用适应性阈值过滤可能污染。分析灵敏度利用含重组噬菌体包裹RNA/DNA的阳性对照样本（positive control samples, PCSs）系列稀释后经概率回归估计检测限（limit of detection, LoD）。

结果部分如下：

**扩增条件的优化**：初步实验显示单池多重PCR存在大量引物二聚体及靶标扩增失败。研究人员根据预测的吉布斯自由能（ΔG）将引物分配到两个池中，使同池内引物间ΔG高于-10 kcal/mol；对扩增不佳的HRSV-A、HRSV-B、FluB/Victoria、HCoV-NL63和SARS-CoV-2重新设计引物。通过退火温度梯度（55–65°C）和引物浓度（0.025–0.075 μM）优化，最终确定池1退火温度58°C、池2退火温度60°C、每引物终浓度0.05 μM；并将MgCl₂终浓度提高到4 mM以改善HMPV扩增。

**分析灵敏度结果**：利用23个靶标的PCSs混合成6个对照面板，在1×10⁵至1×10³拷贝/mL范围内稀释，每浓度4个重复，经全流程处理和测序后以概率回归估计LoD。结果显示，10个靶标的LoD为6.3×10²拷贝/mL；9个靶标介于1.1×10³至9.4×10³拷贝/mL；HPIV-1、HCoV-HKU1、HMPV-B和HMPV-A的LoD分别为7.5×10⁴、7.3×10⁴、7.0×10⁴和1.1×10⁴拷贝/mL。

**临床标本中病毒靶标的检测**：在I组216份PCR阳性标本中，139份（64%）mp-tNGS与PCR完全一致；28份（13%）额外检出其他病毒，多为疱疹病毒；2份仅检出既往共感染中的一种；1份仅检出一种且额外检出未覆盖病毒；46份（21%）未检出PCR阳性的病毒。按聚合分类计算九类病毒的符合性，总体符合率（overall percent agreement, OPA）≥92.6%，阳性符合率（positive percent agreement, PPA）为66.7%–100%，Cohen's kappa系数均≥0.76。II组394份PCR阴性标本中，mp-tNGS在81份检出病毒，其中EBV最多（51份），另有FluA/H3N2（13份）、HPIV-3（4份）、HCoV-HKU1（3份）等。由于该检测为非定量且缺乏血清学数据，EBV检出被描述性分析，不视为当前呼吸事件的病原学证据。III组300份住院标本中，mp-tNGS在131份中至少检出一种病毒靶标；64份与PCR完全一致，7份额外检出EBV或CMV，5份检出与PCR不同的病原，1份仅检出两种病毒中的一种，18份未确认PCR结果；另有54份检出既往PCR未发现的病毒。整体上，mp-tNGS在III组额外识别出9例共感染，使共感染总数增至11例；但额外检出中相当部分涉及EBV和CMV，需谨慎解读。

讨论部分指出，mp-tNGS作为常规PCR的补充，可扩大已知病原检测范围、提供病毒分型信息和共感染识别，但其分析灵敏度在不同靶标间存在不均一性，高LoD的靶标（如HPIV-1、HCoV-HKU1、HMPV-A/B）可能导致部分PCR阳性漏检；生物信息学过滤虽降低了假阳性风险，但可能降低低载量样本的灵敏度。EBV/CMV在呼吸道标本中的检出可能代表潜伏、再激活或活动性感染，必须结合临床背景解读。研究局限性包括引物池靶标范围与既往PCR不完全等价、5种病毒缺乏阳性对照样本及临床信息有限等。未来需添加更多病原、优化引物和扩增均匀性，并进行前瞻性临床验证和标准化。

研究结论：所开发的mp-tNGS方法显示出同时检测多种已知病毒、提供病毒分型和识别共感染的潜力；该方法可作为辅助工具拓宽呼吸道感染的实验室诊断，但需要进一步优化、验证和标准化结果解读标准。