《Fermentation》：Regulatory Effect of Sea Rice Bio-Fermentation Product on the Melanin Synthesis Pathway
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摘要
海稻蕴含多种生物活性成分，其中植酸的高效释放是充分挖掘其功能潜力的关键。本研究构建了酵母与乳酸菌协同发酵体系，制备富含植酸（PA）的海稻发酵滤液（SRF），旨在拓展其作为化妆品原料的应用并促进海稻的高值化利用。采用响应面法优化两株微生物的接种比例及发
摘要
海稻蕴含多种生物活性成分，其中植酸的高效释放是充分挖掘其功能潜力的关键。本研究构建了酵母与乳酸菌协同发酵体系，制备富含植酸（PA）的海稻发酵滤液（SRF），旨在拓展其作为化妆品原料的应用并促进海稻的高值化利用。采用响应面法优化两株微生物的接种比例及发酵时长，并使用商业检测试剂盒定量PA含量。在小鼠B16黑色素瘤细胞中评估SRF的抗黑色素生成活性，并重点阐明其对PI3K/AKT/GSK3β/MITF信号级联的分子调控机制。在最优条件下，即酿酒酵母（SC）接种量4.5%、植物乳杆菌（LP）接种量6.0%、发酵时间18 h时，PA浓度达到576.61 μg/mL。机制研究表明，SRF处理增强了GSK3β磷酸化，这与MITF磷酸化水平降低及下游黑色素生成酶表达下降相关，从而有效抑制黑色素合成，提示SRF作为包含PA等多种生物活性成分的复合发酵产物具有显著的美白功效。综上，这些结果为海稻资源化利用及天然皮肤美白剂的开发提供了新视角，同时有助于延伸海稻产业链价值。
论文解读：海稻生物发酵产物通过调控PI3K/AKT/GSK3β/MITF通路抑制黑色素合成的研究
一、研究背景与意义
海稻（Oryza sativa L.）隶属于禾本科（Poaceae），是由野生稻驯化而来的特色种质资源，相较于常规栽培稻，其对沿海滩涂和内陆盐碱地具有突出的适应性与生长活力。海稻不仅具有基础营养功能，还富含多种生物活性成分，尤其以植酸（phytic acid, PA）含量突出，可达983.4 mg/kg，约为普通稻米的30倍。此外，海稻中还含有谷胱甘肽、黄酮类和β-胡萝卜素等活性物质，具有免疫增强、抗衰老、抗氧化和降血脂等生理调节功能。然而，在植物组织中PA主要以植酸盐或复合物形式存在，生物利用度受限，因此如何高效提取和利用PA成为关键技术瓶颈。双向发酵技术利用微生物胞内酶系催化植物底物转化，可促进活性分子释放、结构修饰甚至新化合物合成，从而增强植物材料的药理活性或拓展其功能应用。目前，关于海稻经双向发酵高效释放PA的具体工艺，以及所得发酵产物发挥美白作用的机制尚未见报道。本研究旨在建立酵母与乳酸菌协同发酵体系，通过响应面法优化发酵条件以富集PA，进而评价发酵滤液的美白功效并阐明其分子机制，为海稻高值化利用和绿色化妆品原料创新提供实验依据。
二、研究内容与主要结论
研究人员以海稻（品种‘Haidao 86’，2024年产自广东湛江沿海盐碱农田）为原料，采用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, SC）GDMCC 2.90和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, LP）GDMCC 1.1797进行协同发酵。通过Box–Behnken设计结合响应面法（RSM）优化SC接种量、LP接种量和发酵时间三个因素，以PA含量为响应值建立二次回归模型。模型决定系数R2=0.9790，F值为36.21（p<0.0001），表明模型拟合度极佳。优化后条件调整为SC接种量4.5%、LP接种量6.0%、发酵时间18 h，验证实验中PA含量达576.61 ± 15.21 μg/mL，与预测值仅差6.3%。所得海稻发酵滤液（SRF）pH为3.82 ± 0.15，总酚含量2.47 ± 0.21 mg GAE/mL，总黄酮含量1.03 ± 0.09 mg RE/mL，主要有机酸为乳酸（12.36 ± 1.02 mg/mL）和乙酸（3.15 ± 0.28 mg/mL）。体外抗氧化实验显示，SRF对DPPH和ABTS自由基均具有浓度依赖的清除活性，50%浓度时DPPH清除率达92.56%（高于15 μg/mL Vc的90.89%），ABTS清除率达93.18%（接近150 μg/mL Vc的93.63%）。细胞实验表明，1.25%–20%浓度SRF显著促进B16细胞增殖，而超过40%则产生细胞毒性。基于安全性，选取1.0%、0.5%、0.2%三个浓度进行黑色素抑制实验，结果显示0.5%和1.0% SRF的抑黑效果显著强于3 mM α-熊果苷阳性对照，其中0.5%组抑制作用最强。机制研究方面，RT-qPCR显示SRF显著下调AKT1、TYR、TRP-1和TRP-2的mRNA表达，其中TYR和TRP-1转录水平分别降至对照的12.76%–34.39%和42.51%–46.59%；Western blot检测显示SRF增强GSK3β Ser9磷酸化（低、中浓度组p-GSK3β达对照的117.40%–131.50%），同时降低MITF磷酸化（p-MITF降至对照的27.79%–54.12%），并下调TYR和TRP-1蛋白表达。这些结果说明SRF可能通过促进GSK3β磷酸化、抑制MITF磷酸化及下游黑色素生成酶表达，最终抑制黑色素合成。该研究首次报道了微生物发酵提取植物源PA的工艺参数，为海稻活性成分的高值化利用开辟了新方向，并为SRF作为天然美白成分在化妆品中的应用奠定了理论基础。
三、关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：
1. 响应面法（RSM）结合Box–Behnken设计：优化SC接种量、LP接种量和发酵时间对PA含量的影响。
2. 高效液相色谱（HPLC）分析有机酸组成（Aminex HPX-87H柱，210 nm检测）。
3. 商业试剂盒定量测定PA含量（苏州格瑞斯生物科技有限公司）。
4. 体外抗氧化活性评价：DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法，以维生素C为阳性对照。
5. 细胞生物学方法：小鼠B16黑色素瘤细胞培养，CCK-8法检测细胞活力，碱性裂解法测定黑色素含量。
6. 分子生物学技术：实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测AKT1、GSK3β、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2基因表达（GAPDH内参，2^?ΔΔCt法）；Western blot检测GSK3β、p-GSK3β（Ser9）、MITF、p-MITF（Ser180）、TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表达（ECL化学发光成像，ImageJ灰度分析）。
样本来源于广东湛江海稻米粒，菌株购自广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）。
四、结果分述
根据原文小标题，研究结果包括以下几个方面：
3.1 响应面分析与海稻发酵优化：通过17次实验建立二次回归模型，方差分析表明SC接种量、LP接种量、发酵时间及AB、AC交互项均显著影响PA含量，三因素贡献顺序为SC接种量>LP接种量>发酵时间。优化后验证实验PA含量达576.61 μg/mL，证实模型可靠。
3.2 因素交互作用分析：三维响应面和等高线图显示AB与AC交互显著（p<0.05），BC交互不显著（p=0.8027）。优化工艺为A=4.5%、B=6.0%、C=18 h，PA含量实际为576.61 ± 15.21 μg/mL，与预测值接近。同时测得SRF的pH、总酚、总黄酮和有机酸组成。
3.3 SRF的体外抗氧化活性：SRF在3.13%–100%浓度范围内DPPH清除率从43.40%升至94.42%，ABTS清除率从16.93%升至99.55%，IC50为15.71%（v/v）。50% SRF的DPPH和ABTS清除活性分别媲美或接近Vc相应浓度，表明其具有强抗氧化能力，且可能含有与PA协同的其他抗氧化物。
3.4 SRF对B16细胞增殖的影响：1.25%–20%浓度显著促进细胞增殖，而>40%时细胞活力降至16%–69%呈细胞毒性。据此选择1.0%、0.5%、0.2%三种无毒浓度用于后续功能研究。
3.5 SRF对B16细胞黑色素合成的抑制作用：0.5%和1.0% SRF的抑黑效果显著强于3 mM α-熊果苷，0.5%组最显著（p<0.001），而0.2%组与对照无显著差异。
3.6 SRF对B16细胞PI3K-AKT-GSK3β-MITF通路的抑制作用：RT-qPCR显示SRF显著下调AKT1、TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表达；Western blot显示SRF增强GSK3β磷酸化、降低MITF磷酸化并抑制TYR和TRP-1蛋白表达，与RT-qPCR结果一致。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，SRF中PA含量低于理化提取法，原因在于发酵过程中微生物植酸酶部分水解PA为低阶肌醇磷酸盐（生物利用度更高），且双向发酵不如强酸、高温等物理化学方法那样能完全释放紧密结合的PA。SRF是包含多酚、黄酮、有机酸和多肽的复合混合物，观察到的活性不能单独归因于PA。与传统的0.5–2.4 mol/L酸化学提取相比，双向发酵具有富集活性成分、改善生物利用度、降解毒性成分、产生新化合物、增强药理活性和环境可持续性等优势。初步对比实验显示，未发酵海稻提取物的自由基清除活性和黑色素合成抑制效果均显著低于SRF，表明发酵显著增强了海稻组分的生物活性。机制分析认为，SRF可能通过增强GSK3β磷酸化来抑制MITF磷酸化，进而下调TYR、TRP-1和TRP-2表达，抑制黑色素合成。针对MITF mRNA在某些处理组升高的现象，讨论提出可能是翻译后调控或代偿性反馈所致，具体机制有待借助功能获得/缺失实验验证。研究局限性包括SRF成分复杂、未鉴定具体活性成分、AKT通路仅在mRNA水平验证、缺乏体内实验，以及发酵滤液中残留淀粉和膳食纤维可能影响稳定性。
结论部分翻译如下：本研究成功建立了酵母和乳酸菌双向协同发酵体系，用于从海稻中高效生产PA。通过响应面法优化，最佳发酵条件为SC接种量4.5%、LP接种量6.0%、发酵时间18 h，此条件下发酵液中PA含量达576.61 μg/mL。所得海稻发酵滤液（SRF）具有强抗氧化活性并显著促进B16细胞增殖。机制上，SRF可能增强GSK3β磷酸化，进而抑制MITF磷酸化并下调其下游关键蛋白TYR、TRP-1和TRP-2，最终抑制黑色素合成、发挥美白功效。由于当前数据的相关性和SRF成分的复杂性，具体活性成分和详细调控网络需进一步系统研究。未来可采用生物测定引导的分馏鉴定活性化合物，并通过功能获得/缺失实验验证机制通路。综上，这些发现为海稻的高值化利用提供了科学基础，也为SRF作为化妆品中天然美白成分的开发奠定了理论基础。
