《BioTech》：Long-Term Labeling and Differentiation Monitoring of Mouse Spermatogonial Stem Cells Using CellREADR
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细胞身份确定和谱系示踪是现代生物学研究中的一项关键技术。尽管许多方法需要复杂的构建流程，但概念上简单且高效、具有更广泛应用性的细胞标记技术仍然值得期待。ADAR（adenosine deaminase acting on RNA，作用于RNA的腺苷脱氨酶）介导
细胞身份确定和谱系示踪是现代生物学研究中的一项关键技术。尽管许多方法需要复杂的构建流程，但概念上简单且高效、具有更广泛应用性的细胞标记技术仍然值得期待。ADAR（adenosine deaminase acting on RNA，作用于RNA的腺苷脱氨酶）介导的RNA传感就是这样一种技术，它是一种基于细胞类型特异性RNA的表达和丰度进行活细胞标记的技术。本研究利用优化版本CellREADR（Cell access through RNA sensing by Endogenous ADAR）建立了一套适用于小鼠精原干细胞（mSSCs）的可行示踪系统，而mSSCs难以进行基于CRISPR的报告基因敲入。研究人员发现了CellREADR此前未报道的几个特征，包括在CellREADR系统正常运行期间必然形成的双链RNA所诱导的RNA干扰。更重要的是，研究人员确立了该系统在mSSCs长期标记以及体外维甲酸（RA）处理诱导的mSSC分化监测中的应用。这项工作为动态监测mSSCs自我更新和分化提供了实用方案，并支持CellREADR可被开发成干细胞研究中更通用、更高效的工具。
细胞身份鉴定与谱系示踪是现代生物学研究的重要技术。现有常用方法如逆转录定量PCR（RT-qPCR）、免疫染色或组学检测往往会损伤细胞；CRISPR/Cas9报告基因敲入虽可实现活细胞监测，但成功率低、耗时长，并可能破坏内源基因。ADAR介导的RNA传感利用内源ADAR将细胞类型特异性RNA识别转换为报告信号，无需引入外源Cas9样蛋白。CellREADR作为该技术的优化版本，可在不进行基因组编辑的情况下标记活细胞，但其特性尚不清楚，也未用于干细胞分化示踪。精原干细胞（SSCs）在生殖和动物育种中有重要价值，但大动物SSCs难培养；小鼠精原干细胞（mSSCs）是最常用模型，却难以进行CRISPR敲入，同源重组效率低，靶位点染色质开放性差。因此，研究人员系统检验了CellREADR用于mSSCs标记与分化监测的可行性。该研究发表于《BioTech》。
研究人员主要采用以下关键技术方法：设计靶向细胞类型特异基因的传感器RNA（sesRNA），构建含mCherry报告基因与copGFP效应基因的CellREADR载体；通过脂质体转染HEK293FT、HeLa、STO、小鼠胚胎干细胞（mESCs）等细胞，采用慢病毒感染mSSCs（细胞来源于3月龄C57BL/6小鼠），结合流式细胞术、RT-qPCR、免疫荧光染色和Western blot评估标记效率；最后用100 nM维甲酸（RA）处理标记mSSCs以监测分化。
### 3.1 Validation and Further Characterization of CellREADR
研究人员在HEK293FT细胞中以EEF1A1为靶标验证CellREADR。结果显示，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）可显著提高阳性信号；同时，RNA传感会优先降低外源含sesRNA转录本水平，而非内源靶RNA，提示存在RNA干扰（RNAi）机制。
### 3.2 Mismatch Optimization and Mutation Detection of CellREADR
通过设计共享相同序列背景的A:A、A:G、A:C错配sesRNA，研究人员发现A:C错配效率最优，A:A和A:G错配也可作为替代；TAG与TGA终止密码子均可形成A:C错配且效率无显著差异。针对FANCF和EMX1单碱基突变mRNA的检测显示，存在突变质粒时细胞转化率显著升高，表明CellREADR可检测特定位点突变，但灵敏度仍有待提高。
### 3.3 Distinguishing Two General Cell Lines by CellREADR
比较HeLa和HEK293FT转录组后，研究人员选择KRT7和NEFM作为标志基因。ses-NEFM-W在HEK293FT细胞中阳性率约12%，在HeLa细胞中仅背景水平，证明CellREADR可区分常用细胞系；但ses-KRT7-W无差异，说明标志基因需经实验筛选验证。
### 3.4 Limited Accuracy of CellREADR for Targeting Similar Sequences
为检测相似序列区分能力，研究人员构建了稳定表达密码子优化人GDNF（opti-cod huGDNF）的STO-GDNF细胞。将ses-GDNF-W转入STO和STO-GDNF细胞后，两者阳性率几乎相同；在HEK293FT细胞中瞬时表达opti-cod huGDNF也未增加转化率，说明CellREADR对多错配的高度同源序列具有耐受性，难以区分相似序列。
### 3.5 Stem Cell Lines Identification by CellREADR
研究人员检测到mESCs和mSSCs表达ADAR1和ADAR2。ses-Klf4-W能特异标记mESCs，而ses-Oct4-W无效。用慢病毒递送靶向Plzf的ses-Plzf-W可特异标记MEF饲养层中的mSSCs，标记细胞形成克隆并维持至少两个月，证明CellREAD
