《Horticulturae》：Identification and Characterization of MicroRNAs and Their Targets That Respond to Powdery Mildew in Melon
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为鉴定响应白粉病（Powdery Mildew，PM）侵染的微RNA（microRNA，miRNA）并阐明其在甜瓜PM抗性中的调控作用，从而为解析潜在分子机制奠定基础，研究人员结合高通量测序与生物信息学分析，利用PM抗性和PM感病甜瓜基因型筛选PM响应miRN
为鉴定响应白粉病（Powdery Mildew，PM）侵染的微RNA（microRNA，miRNA）并阐明其在甜瓜PM抗性中的调控作用，从而为解析潜在分子机制奠定基础，研究人员结合高通量测序与生物信息学分析，利用PM抗性和PM感病甜瓜基因型筛选PM响应miRNA及其靶基因。两组基因型中总计鉴定出113个非冗余miRNA，包括70个已知和43个新miRNA。差异表达分析显示抗性与感病基因型对PM侵染的miRNA响应不同。接种PM后，13个miRNA在感病与抗性基因型中均显著差异表达；miR164c、miR396a、miR398a和miRn39仅在感病基因型中差异表达；miR167c、miR398b、miR399g、miR530a和miRn8仅在抗性基因型中差异表达。基因本体（Gene Ontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析表明，这些miRNA通过调控植物免疫稳态、抗氧化代谢和病原触发细胞死亡介导甜瓜对PM的感病或抗性。定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）验证证实PM响应miRNA与其预测靶基因表达呈负调控关系。上述结果可为甜瓜PM抗性相关miRNA功能及调控机制研究提供新见解与候选靶点。
研究背景方面，甜瓜（Cucumis melo L.）为葫芦科重要经济作物，生育后期易感染由专性活体营养真菌 Podosphaera xanthii 与 Golovinomyces cichoracearum 引起的白粉病（Powdery Mildew，PM），导致叶片黄化、坏死、光合受损及产量品质下降。虽然模式植物中已证实微RNA（microRNA，miRNA）可调控植物免疫，但甜瓜中PM抗性相关miRNA及其靶基因功能仍缺乏系统研究。研究人员拥有广谱高抗自交系M1与感病自交系B29，因此开展小RNA（small RNA，sRNA）测序与靶基因分析，以解析抗、感基因型早期免疫中的miRNA调控网络。该研究发表于《Horticulturae》。
主要技术方法上，研究人员以PM抗性自交系M1与感病自交系B29为材料，取三真叶期叶片，用 Podosphaera xanthii 分生孢子悬浮液接种，设置对照与接种后24、48小时样本，每处理9株、每时间点3个生物学重复。构建sRNA文库并高通量测序；用Bowtie2比对甜瓜参考基因组与Rfam以过滤非miRNA，用miRBase鉴定已知miRNA，用miReap预测新miRNA；以DESeq2做差异表达分析；用psRNATarget预测靶基因，并进行GO与KEGG富集；以茎环反转录结合qRT-PCR验证miRNA及靶基因表达。
3.1. The Phenotype Analysis of M1 and B29 Against PM：通过抗、感材料接种后0、7、14天表型观察，B29一周出现白色粉斑、两周覆盖全叶，M1无可见症状，证明材料抗性差异可靠；因分生孢子12小时内萌发侵入、24至48小时形成吸器定殖，故选24和48小时采样研究早期免疫。
3.2. Overview of sRNA Profiles in Melon：18个sRNA文库每条产出约12.09至15.88百万读段，80.12%至82.92%可比对甜瓜基因组，重复间Pearson相关r>0.8；sRNA长度以22 nt最多，其次21 nt与24 nt，PM侵染不改变整体长度分布。
3.3. Identification of Known and Novel miRNAs in Melon：比对miRBase获70个已知miRNA归29个家族，其中25个跨物种保守，4个为物种特有；其余读段经发夹结构预测得43个新miRNA（miRn1至miRn43）；70已知与43新miRNA在抗、感材料对照与接种样本中均存在。
3.4. Differential Expression of miRNAs in Response to PM Infection and qRT-PCR Validation in Melon：差异分析显示感病型12上调、6下调，抗性型11上调、7下调；miR398b、miR399g、miR530a、miRn8仅在抗性型上调，miR167c仅在抗性型下调；miR164a、miR397、miR477未接种时抗性型基础表达更高；8个miRNA的qRT-PCR结果与测序一致。
3.5. Target Gene Prediction and Functional Characterization of Differentially Expressed miRNAs：21个差异miRNA预测到187个靶基因，miR408靶基因最多（23个），miRn11最少（2个）；GO显示靶基因多属生物过程，KEGG显著富集植物-病原互作（plant–pathogen interaction）与MAPK信号通路，说明miRNA经免疫与蛋白激酶信号参与抗病。
3.6. Correlation Analysis Between miRNAs and Target Gene Expression：qRT-PCR检测miR167c、miR398b、miR399g、miRn8的8个靶基因；抗性型中miR398b靶基因 MELO3C026955（超氧化物歧化酶）与 MELO3C008957（LRR受体样激酶）、miR399g靶基因 MELO3C017200 与 MELO3C021852、miRn8靶基因 MELO3C003188 与 MELO3C023120 均随对应miRNA上调而下调；miR167c靶基因 MELO3C025737（Dof转录因子）与 MELO3C002443（F-box蛋白）在抗性型上调，符合典型miRNA-靶基因负调控。
讨论部分总结：已有研究将葫芦科PM抗性分为NBS-LRR介导的小种专化抗性与mlo功能缺失带来的广谱抗性；本研究首次系统报道甜瓜PM相关miRNA。甜瓜sRNA以22 nt为主，不同于水稻等24 nt占优，提示miRNA/反式作用siRNA（trans-acting siRNA，ta-siRNA）精细调控更主导。抗性型特异上调的miR398b可抑制超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）基因、促进H2O2积累与过敏响应；miR399关联磷代谢与细胞壁强化；感病型特异的miR164c抑制NAC转录因子、miR396a抑制GRF转录因子，削弱活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）爆发、胼胝质沉积与抗病基因表达，从而促进感病。KEGG中植物-病原互作与MAPK级联说明miRNA通过解除负调控或激活正调控增强病原识别与免疫信号。
结论部分翻译：既往研究表明病原侵染会触发多种植物中miRNA的差异积累，这些病原响应miRNA进一步调控参与植物-病原互作的下游靶基因。本研究鉴定了甜瓜中参与植物-病原互作通路与MAPK信号通路的PM响应miRNA及其靶基因，并系统揭示了防御响应下miRNA的调控机制。这些发现为从miRNA视角理解甜瓜对PM感病与抗性的分子机制提供理论基础，也为PM抗性甜瓜分子育种提供潜在分子标记与靶基因，具有重要理论与应用价值。
