人工智能增强的数字全息显微技术用于工业微藻跑道池的实时监测与早期污染检测

《Algal Research》：AI-enhanced digital holographic microscopy for real-time monitoring and early contamination detection in industrial microalgae raceway ponds

　　

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  AI增强的数字全息显微镜（DHM）实现了对工业微藻的无标记监测。
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  Efficient Net对训练后的藻类、聚集体和轮虫类别进行了分类。
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  HoloDetect的变异系数为3.03%，而手动计数的变异系数为9.2%。
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  在1 mL分析样本中，轮虫的LOD95为14.6轮虫/mL。
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  为期两周的600 m²池塘试验实现了对种群的高频追踪。

引言

大规模微藻生产已成为解决全球可持续性挑战最具前景的生物技术解决方案之一，包括二氧化碳减排、营养盐回收以及可再生生物基产品的生产。过去十年间，该行业已从实验室研究发展到工业规模部署，全球众多商业设施展示了其在可持续生物量生成和碳中和制造方面的潜力[1]。开放式跑道池塘和管式光生物反应器等系统能够以较低成本实现生产，同时通过对废水流的增值利用和关键营养盐的回收，支持循环生物经济的目标[2]；然而，这些系统在大规模应用的可行性仍然受到生物不稳定性因素的严重制约，尤其是污染事件的发生，这些事件可能严重降低生产力并破坏培养物的存活性。在这些污染物中，捕食性食草动物如轮虫、原生动物和纤毛虫，以及竞争性藻类物种是最常见且最具破坏性的污染源，能够在数天内导致整个培养物崩溃[3][4]。这些风险在开放式池塘系统中尤为突出，因为环境暴露使得有害生物更容易侵入。因此，在户外操作条件下维持单克隆培养需要有效的策略，包括早期检测、快速诊断和针对性干预，以防止培养物崩溃和经济损失。

针对不同的生产系统，已开发了各种预防和纠正措施来控制污染。在封闭式光生物反应器中，预防措施通常依赖于无菌操作，包括培养基灭菌、空气和CO₂输入的过滤以及与环境的物理隔离[5]。相反，开放式跑道池塘依赖于选择性环境控制，例如维持有利于目标菌株的高pH值或盐度水平、优化水动力学以限制食草动物定殖，以及在污染发生后采取生物或化学对策[6]。控制手段包括光芬顿氧化、次氯酸盐处理以及使用能够选择性灭活食草动物而不损害藻类种群的天然杀生物剂或表面活性剂[7][6]。尽管采取了这些策略，培养物污染仍然是限制微藻生物过程工业化规模化的最具持续性的挑战之一。

鉴于污染可能迅速传播，早期检测对于维持过程稳定性和避免重大生产力损失至关重要。表1总结了大规模微藻生产系统中用于实时、可扩展且具有成本效益的污染检测的最相关方法。基于人工显微镜的传统监测方法仍然是检测食草动物和污染物的标准方法，但该方法劳动密集、主观性强，且不适用于实时决策[8]。针对这些局限性，近年来光学传感、自动化和机器学习领域的进展催生了一批无创、高频监测工具，能够在可见的培养物退化发生之前识别出微妙的生物变化。其中，FlowCAM成像流式细胞术已成功应用于微藻培养物中轮虫食草动物的早期检测和定量，检测限低至0.1个体/mL^?1[9]。最近，光谱学和基于AI的方法（包括紫外-可见分光光度法、近红外（NIR）和高光谱成像）已被证明能够识别表明污染或群落组成变化的异常光谱指纹[10]。当与卷积神经网络（CNN）或其他深度学习架构结合时，这些系统能够自动分类微藻并以高准确率检测到异常或混合培养物，为连续过程监测提供了可扩展且具有成本效益的解决方案[9]。FlowCAM和数字全息显微镜等互补成像平台提供了详细的形态学信息，增强了自动分类的鲁棒性，同时避免了染色或标记的需要[11]。

除了直接光学技术之外，还有几种间接检测方法被用于微藻生产系统中污染事件的早期识别。其中，挥发性气体和代谢物分析在检测早期食草动物活动方面显示出潜力，因为食草诱导的代谢应激可能在可见生物量损失之前触发特定挥发性有机化合物的释放[12]。这些方法能够实现无创监测，并可在受控条件下提供早期预警信号。与此同时，基于分子生物学的方法（包括qPCR、DNA条形码和高通量测序）能够对捕食性生物（如Poterioochromonas）进行高度灵敏且具有物种特异性的检测，即使在非常低的丰度或休眠阶段也是如此[13]。这些技术在确认性分析和污染事件的详细生态表征方面尤为有价值。然而，尽管这些间接方法具有强大的分析能力，但它们在常规工业应用中存在显著局限性。挥发性分析通常需要复杂且昂贵的仪器设备，而分子检测涉及离线采样、专业实验室和经过培训的人员，导致响应时间延迟。因此，它们在大规模户外系统中连续实时监测的适用性有限。因此，间接方法最好被视为补充诊断工具，而非独立的污染控制运营方案。

将人工智能与数字全息成像相结合，为微藻培养物的连续、自动化和客观监测提供了一种强大的方法。这种集成不仅提高了污染检测的准确率，还支持了配备预测性监测和控制功能的智能光生物反应器的开发。此外，高频生物和形态学数据的持续采集使得高级种群演变和生态互作模型的开发成为可能，从而加深了对大规模微藻培养系统中复杂动态的理解、预测和管理。因此，本研究的目标是开发并验证一种AI增强的数字全息显微镜系统，能够实时检测和分类大规模跑道池塘中的微藻及污染物。所提出的方法将体积样本的全息成像与人工智能算法相结合，以在真实操作条件下执行自动细胞分类、形态学分析、种群追踪和污染检测。通过实现连续、无标记的监测，该方法最大限度地减少了对人工检查的依赖，增强了过程的鲁棒性，并确保生物量质量的一致性。此外，其较低的实施成本以及与工业生产系统的兼容性使其成为微藻生物精炼厂数字化转型的可扩展解决方案，为实现可持续工业生物过程的自主、预测和数据驱动管理这一更广泛的目标做出贡献。

章节摘要

微藻培养物与样品制备

本研究进行了两系列实验测量。在第一系列中，采用小团藻属（Scenedesmus sp.）的纯培养物进行校准和定量验证，同时使用HoloDetect数字全息显微镜（DHM）系统和常规光学计数法（布勒曼血细胞计数板作为参考方法）进行分析。在第二系列中，HoloDetect系统被应用于监测在户外操作条件下于开放式跑道池塘中培养的微藻培养物。

分类模型的开发

分类模型是使用HoloDetect数字全息显微镜系统的集成软件平台开发的，该平台将实时成像、传感和数据分析相结合，用于微藻监测。该系统利用激光照明和CMOS传感器捕获流过透明腔室的细胞的全息图像，从而能够在无需染色或机械对焦的情况下，无标记地重建高分辨率的三维形态轮廓。

结论

本研究证明，将数字全息显微镜与人工智能相结合，为工业微藻生产系统的实时监测提供了一种鲁棒且可扩展的解决方案。HoloDetect显微镜成功实现了对真实户外操作条件下高产微藻种群、聚集体和生物污染物的自动识别、分类和定量。基于AI的分类模型取得了高准确率。

CRediT作者贡献声明

M. Ahaddouch：调查研究。R. Esteitie：软件、方法学。á. Zarándy：验证。B. Bicsák：概念设计。

参与同意

不适用。

出版同意

不适用。

伦理审批

不适用。本研究不涉及人类受试者、人类数据、脊椎动物或临床样本。

资金来源

本研究由欧盟通过COSEC项目（资助协议编号：101172850）、NIAGARA项目（资助协议编号：101146861）和NAMOR项目（资助协议编号：101182365）资助。然而，文中表达的观点和意见仅代表作者本人，不一定反映欧盟或欧洲委员会的立场。欧盟或资助机构亦不承担任何相关责任。

利益冲突声明

á. Zarándy和B. Bicsák隶属于HOLODETECT有限公司，该公司是本研究中评估的HoloDetect系统的制造商和商业化供应商。他们对技术开发和描述所作的贡献已在作者贡献部分中说明。其余作者声明不存在任何竞争性财务或非财务利益。

致谢

作者感谢参与机构提供的技术和机构支持，以及阿尔梅里亚大学CIESOL研究设施的支持。

M. Ahaddouch|?.K. Botero|R. Esteitie|á. Zarándy|B. Bicsák|F.G. Acién