利用循环离子淌度和串联质谱分离鉴定人参中达玛烷型皂苷异构体

《Analytica Chimica Acta》：Separation and identification of dammarane-type ginsenoside isomers from Panax ginseng using cyclic ion mobility and tandem mass spectrometry

　　

摘要

背景

达玛烷型人参皂苷（DTGs）表现出广泛的异构现象，包括苷元异构体、糖基化位点异构体、双键位置异构体和R/S构型异构体。许多这些异构体在液相色谱中共流出，仅靠串联质谱（MS/MS）难以区分，从而影响了人参提取物中鉴定的准确性。因此，需要一种更系统的方法来分离和鉴定这些异构体。

结果

在参比标准和人参提取物上验证了多循环离子淌度（cIMS）对于解析挑战性DTG异构体的能力。在优化阱碰撞能量后，通过整合MS/MS数据、完整DTGs的CCS值及其特征苷元片段的CCS值，建立了一套系统的假定鉴定策略。该方法能够区分苷元异构体、糖型异构体、糖苷键连异构体、糖基化位点异构体、R/S构型异构体和双键位置异构体，显著提高了鉴定的可靠性。

意义

同源苷元的特征CCS值提供了一种互补方法，用于推断C-20的R/S构型，这可能有助于解决传统质谱在某些情况下的关键局限性。虽然本研究聚焦于人参皂苷，但该工作流程——特别是MS/MS与苷元CCS数据的整合——可能为具有类似异构复杂性的其他天然产物中的异构体鉴定提供有用的参考。

引言

人参（Panax ginseng C. A. Meyer），被誉为"百草之王"和"医药之首"，在世界各地的各种中药制剂、保健品、食品添加剂和化妆品中被广泛使用[1]、[2]、[3]。人参含有多种化学成分，包括人参皂苷、多糖、挥发油、有机酸、生物碱、多肽、葡萄糖苷、酚酸和微量元素[4]、[5]。其中，人参皂苷被认为是人参的主要生物活性成分和化学标志物[6]。它们由一个疏水性四环甾体系统组成，在C-3、C-6和C-20位连接有各种糖基（如葡萄糖Glc、鼠李糖Rha、木糖Xyl和阿拉伯糖Ara）[5]。大多数人参皂苷属于达玛烷型皂苷（DTGs），分为四类：原人参二醇（PPD）、原人参三醇（PPT）、奥科蒂醇（OT）和C-17侧链变异（C17SCV）型[7]。其中，PPD和PPT亚型占绝大多数[8]、[9]。它们的主要区别在于C-6位是否存在羟基以及糖基连接的位点[10]。

这些DTG表现出广泛的异构现象，源于皂元结构的差异、糖取代基类型、取代位点、糖基连接顺序、构象异构和双键位置异构[11]、[12]。这种高度异构性，加之参比化合物的匮乏，使得DTG的准确表征极具挑战性。因此，获取更详细的结构信息对于更准确地鉴定DTG至关重要。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）因其高灵敏度和广泛的代谢物覆盖能力，已成为化合物鉴定的主要工具和人参皂苷分析的核心方法。它被广泛应用于物种鉴定[13]、地理来源[14]和栽培年限判别[15]，以及人参属植物的工艺[16]和生物转化监测[17]。质谱技术在解决人参皂苷结构表征和异构体区分的长期植物化学挑战方面具有独特优势。采用各种离子解离技术的现代仪器，通过分析MS/MS光谱中的特征碎片离子及其相对丰度，能够区分苷元类型并确定糖基的数量、位置和连接方式[18]、[19]、[20]、[21]。

将LC-MS/MS与离子淌度光谱（IMS）结合可实现人参皂苷的多维鉴定，例如已建立的离子淌度数据库GinMIL[22]。然而在实际操作中，预测值与实验测量碰撞截面（CCS）值之间固有的偏差[1]，加之跨平台测量比较的难度，意味着CCS值通常只能作为相对于经验定义范围的相对参考，而非精确鉴定的绝对标准。因此，当面对具有等质量、高度相似质谱和极其接近CCS值的复杂异构体时——特别是双键位置异构体和R/S构型异构体——现有方法的分离能力和鉴定准确性已达到瓶颈。由此类异构体产生的混合MS/MS光谱难以明确解释，经常导致结构归属的不确定性。

循环离子淌度光谱-质谱（cIMS-MS）近年来作为一种新型超高分辨率技术崭露头角。通过多循环延长离子分离路径长度，cIMS-MS实现了比传统IMS高得多的分辨率，并能够进行IMSⁿ实验，逐步选择、碎裂和重新分离特定离子[23]、[24]。该技术已显示出解析复杂异构体混合物的巨大潜力，包括黄酮类化合物[25]、低聚糖[26]和甘油三酯异构体[24]。然而据我们所知，目前尚无系统研究报告使用该方法分离人参皂苷异构体。

为填补这一空白，我们系统地研究了使用多循环cIMS分离DTG异构体的行为，评估了单循环和多循环条件下的CCS值，并建立了结构与淌度的关系——特别是C-20构型与苷元CCS之间的关系。我们还通过高能阱活化获得了苷元片段的CCS值，为区分R/S构型提供了关键证据。此外，我们通过整合LC-MS/MS与CCS测量，开发了人参提取物的实用鉴定工作流程，其中MS/MS数据用于区分苷元类型和糖苷键连，而完整离子和苷元片段的CCS值则作为双键位置异构体和R/S构型异构体的正交描述符。

章节摘要

化学药品和试剂

从成都德思特生物科技有限公司（成都，中国）共获得了25种DTG参比化合物（表S1）。LC级乙腈、甲醇（Merck，德国）和甲酸（阿拉丁，中国）用作流动相添加剂。超纯水使用Milli-Q Integral 5纯水系统（Millipore，美国马萨诸塞州Bedford）制备。

将每种化合物1 mg溶于1 mL甲醇中，制备单体储备液（1000 μg/mL）。混合工作液含有

DTG异构体的分离

DTG具有众多R/S构型异构体，它们在色谱中保留时间几乎相同——通常仅相差±0.1 min——且质谱几乎无法区分。这大大增加了误鉴定的风险，特别是在人参属植物提取物中这些异构体经常共存的情况下。为此，我们使用不同循环次数的cIMS-MS研究了DTG异构体的分离：0循环、单循环和多循环。结果

结论

本研究开发并验证了一种利用cIMS-MS系统鉴定DTG异构体的新策略，显著提高了其鉴定准确性。该策略包含两个关键组成部分：(i) 使用多循环离子淌度快速分离复杂异构体；(ii) 将MS/MS数据与高精度CCS值（特别是苷元的CCS值）整合，建立鉴定的多维证据基础。该方法克服了

CRediT作者贡献声明

盛振华：验证、形式分析。何兵谦：原创写作、方法论、形式分析。戴凌浩：验证、方法论。王林艳：写作—审阅与编辑、原创写作、验证、项目管理、方法论、形式分析、概念化。关杨：原创写作、方法论、形式分析、数据整理

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致谢

本研究得到中国医学科学院自然科学基金、浙江中医药大学（编号：2023ZZ13）和浙江中医药大学自然科学基金（编号：2024JKZKTS34）的资助。

关杨|何兵谦|盛振华|戴凌浩|王林艳

中国医学科学院，浙江中医药大学，浙江省杭州市 310053，中国