顺序注射与高效液相色谱在线耦合对定量干燥物质斑点进行自动分析：概念验证

《Analytica Chimica Acta》：Automatic analyses of quantitative dried material spots by on-line coupling of sequential injection to high-performance liquid chromatography: A proof-of-concept

　　

## 摘要

### 背景
开发并整合能够可靠处理干式材料斑点（DMSs）的平台，作为先进分析仪器的前端，仍然面临方法学上的挑战。尽管已有机器人平台被开发用于自主操作干血斑（DBS）卡片，但这些系统在辅助单元操作方面灵活性有限，并且与定量DMS（qDMS）设备不兼容。

### 结果
本概念验证工作利用先进的液体处理技术，采用现成的流体组件，利用顺序注入-高效液相色谱（SI-HPLC）联用的多功能性，实现DMSs的自动处理和分析。该流路设置以多位旋转阀作为SI流路的核心，连接两个3D打印的60位置卡架。这种联用技术通过精确分配微升级甲醇对斑点进行再水化和蛋白质沉淀，随后将洗脱液与水混合均质化以实现与HPLC的兼容性，从而能够灵活地在管内对多种DBS、qDBS、qDMS和体积吸收微采样（VAMS）样品进行处理。

以模型非甾体抗炎药为示例，该完全同步的SI-HPLC装置实现了多达120个DMS样品的完全无监督分析，每个洗脱液进行三重HPLC进样（每次8.2分钟）。采用基质匹配校准，即加入10 μL不含分析物的血液，多个qDBS使用135 μL甲醇洗脱，随后用135 μL水调整洗脱液组成，再进行反相HPLC分析。在此条件下，校准在线性范围为15–60、0.8–12、0.8–6和6.2–100 μg mL?1，萘普生、酮布洛芬、双氯芬酸和布洛芬的检出限分别为5.7、0.3、0.3和1.4 μg mL?1。日内实验的精密度为2.3–12.7% RSD，日间实验的精密度为9.3–13.2% RSD。与手动qDBS处理并采用毛细管电泳离线分析相比，在0.05水平上浓度无统计学差异，证明了所提出的自动SI-HPLC装置在具有治疗性萘普生浓度的qDBS中的可靠性。

### 意义
所提出的分析概念首次实现了各种DMS和qDMS样品的自动处理和分析，同时使用标准的现成SI和HPLC组件以及免费的控制软件。

## 引言

个性化医疗的兴起要求频繁进行纵向采样，以监测药物反应、疾病进展或随时间变化的生物标志物。传统的静脉穿刺采血面临诸多挑战，包括需要专业人员的操作、样本运输中的物流障碍以及冷链储存的需求。干式材料斑点（DMS）特别是干血斑（DBS）采样提供了一种有吸引力的替代方案，能够实现去中心化的样本采集，符合日益增长的以患者为中心的护理需求[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。

DBS采样因采集、运输和储存的便捷性，在临床诊断、药代动力学和群体健康研究中获得了广泛关注[3]、[5]、[6]、[8]、[12]。然而，传统的DBS采样方法在定量测定中由于血液分布不均匀和红细胞压积效应，存在显著的分析变异性[13]、[14]、[15]。由于定量生物分析需要高精度、高精密度和高重现性，特别是在治疗药物监测（TDM）、代谢组和生物标志物定量方面，采集在纤维素采样卡上的传统DBS由于固有的不一致性而不适用于此目的。受未受控的样本体积、变化的红细胞压积水平和色谱效应驱动[13]、[14]、[15]，这些缺陷限制了传统DBS在精度至关重要的严格定量分析中的使用。相反，体积DBS（例如体积吸收微采样（VAMS）和定量DBS（qDBS））通过采集和再水化已知体积的毛细血管血，提供了一种标准化的方法，从而确保更高的均匀性并减少定量分析中的误差[6]、[7]、[9]、[11]。事实上，近期研究表明qDBS非常适合临床自我采样和分析[16]、[17]。此外，新型的定量DMS（qDMS）采集设备最近已商业化[18]、[19]、[20]。

虽然qDBS和qDMS在样本一致性和定量分析的可靠性方面相比传统DMS有显著改进，但多个实际和技术挑战阻碍了它们的广泛采用，特别是在高通量、自动实验室工作流程中。与遵循标准化格式（例如Whatman? 903）的传统纤维素采样卡不同，qDMS设备和采样吸附剂具有各种形状、材料和尺寸[18]、[19]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。这种异质性使qDMS无法整合到为统一的DBS卡片设计的现有自动平台中[26]。因此，qDMS制备的多个步骤（即采样吸附剂与设备的分离、装入样品管、在多种制备仪器之间的转移）以及最终转移到分析仪器，几乎完全依靠手动操作。

最近，本课题组证明单一的商用毛细管电泳（CE）仪器可以用于全面的DBS制备以及后续对所得DBS洗脱液的进样和分析[27]、[28]、[29]。所有制备程序，包括液体处理、DBS再水化、洗脱液均质化和进样，均在CE自动进样器内的CE样品管中完成，且无需任何硬件或软件修改。此外，由于CE系统可以使用各种内部体积的样品管操作，上述概念提供了高度灵活性，兼容多种DBS采集设备，并且适用于各种qDBS格式的完全自动分析[30]、[31]、[32]。

尽管CE具有若干不可替代的优势，如与高效液相色谱（HPLC）相比成本低、分离效率高、分析时间短和样品消耗最少，但后者被认为是临床分析的金标准工具。主要原因在于HPLC在定性及定量参数方面具有更高的稳健性。因此，当前的DBS卡片自动处理平台是为与HPLC及HPLC/MS仪器联用而设计的[26]，但没有进一步扩展到qDBS和qDMS的处理和分析。事实上，仅发表了一份关于使用笨重且复杂的岛津CLAM-2030样品制备系统在HPLC-MS/MS测定之前进行自动qDBS分析的报告，用于分析从hemaPEN设备分离的预切纤维素qDBS圆盘中的他克莫司[33]。然而，本课题组之前研究的根本原理，例如通过CE进行的DMS再水化、洗脱和均质化，可以转移到其他联用技术中，并且可以与其他分离方法联合使用。

本文首次提出了一个新颖的完全自动方法用于分析各种DMS样品的概念验证研究。它为DMS处理提供了前所未有的灵活性，能够处理标准DBS、qDBS、VAMS以及定量干血浆斑点（qDPS），并对所得洗脱液进行后续HPLC分析。通过使用低压高级流分析流路——即顺序注入（SI）——实现了各种有机和水溶液的高度多功能双向流体操纵。SI能够完全自动地进行DMS再水化、将洗脱液与各种试剂混合以实现与HPLC的兼容性、洗脱液的均质化，以及使用外部自动进样器探针将其转移到HPLC仪器的进样环进行分析。以模型非甾体抗炎药（NSAIDs）为研究对象，研究并优化了各种DMS分析参数，包括再水化时间、抽吸/分配循环、交叉污染效应、洗脱液与反相HPLC的兼容性以及处理/分析的同步。最优条件随后被应用于监测真实qDBS样品中的治疗性萘普生浓度，并检验其对各种DMS采集设备的适用性。

## 部分片段

### 试剂和标准溶液
所有化学品均为分析纯级别。来自Milli-Q Advantage A10水纯化系统（Merck-Millipore，德国达姆施塔特）的Milli-Q水，电阻率> 18 MΩ·cm。布洛芬（≥ 98%）、萘普生钠盐（≥ 98%）、酮布洛芬（≥ 98%）和双氯芬酸钠盐（≥ 98%）（均来自Merck KGaA，德国斯坦海姆）被用作模型NSAIDs。其储备液在纯甲醇（Optima MS级，Fisher Scientific SL，Hampton）中配制为10 mg mL?1浓度。

### 洗脱液与HPLC的兼容性以及手动DMS洗脱
洗脱液的组成及其与后续HPLC方法的兼容性是HPLC自动DMS分析中最关键的方面[26]。这是因为大多数DMS洗脱过程需要高含量的有机溶剂来消除血液基质成分，而所得的高有机洗脱液与梯度反相HPLC方法的兼容性较差，这是由于峰展宽效应。因此，SI-HPLC联用的一个明显优势是能够……

## 结论

本概念验证研究表明，灵活的流体SI平台适合作为HPLC的前端，用于各种DMS样品的自动处理和分析。所提出的在线SI-AIM-HPLC-UV方法使用了现成的流体组件和免费的控制软件。它利用各种有机和水溶液的高度多功能双向流体操纵，实现了管内样品的完全无人值守处理和分析，用于自动DMS的采集和……

## CRediT作者贡献声明

Carlos Pagan Galbarro：撰写——初稿、方法论、调查研究。Milo? Dvo?ák：撰写——初稿、方法论、调查研究。Pavel Kubáň：撰写——审阅与编辑、监督、方法论、资金获取、概念化。Manuel Miró：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。

## 利益冲突

其中一位作者（MM）是《分析化学学报》的副主编，但未参与本稿件的处理。

## 数据可用性声明

所有相关数据可在ASEP数据仓库中获取，网址为 https://doi.org/10.57680/asep.0652175。

## 竞争利益声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在竞争利益：其中一位作者（Manuel Miró）是《分析化学学报》的副主编，但未参与本稿件的处理。

## 致谢

衷心感谢捷克共和国资助局（资助编号23-05972S）、捷克科学院（研究所研究资助RVO:68081715）、西班牙国家研究局（AEI/10.13039/501100011033）和西班牙科学、创新与大学部（MICIU）通过项目PID2024-156804OB-C33（MICIU/AEI/10.13039/501100011033/FEDER，EU）提供的财政支持。CPG感谢巴利阿里群岛大学分配的博士学位。

Milo? Dvo?ák | Carlos Pagan Galbarro | Manuel Miró | Pavel Kubáň

捷克科学院分析化学研究所，Veve?í 97，CZ-60200 布尔诺，捷克共和国