蛋白质 -DNA 相互作用等温滴定量热法的最佳实践

《Analytical Biochemistry》：Best practices for isothermal titration calorimetry of protein–DNA interactions

　　

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  为蛋白质-DNA ITC实验故障排查提供了一份实用检查清单
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  技术伪影可能掩盖或模拟蛋白质-DNA结合行为
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  准确的浓度和匹配的缓冲液是可靠热力学拟合的关键
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  清洁、装载、脱气和校准检查可提高ITC的可重复性
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  该工作流程帮助研究人员在解读结合数据之前识别可纠正的伪影

章节摘要

面向更广泛受众的声明

与DNA结合蛋白质有助于控制基因何时开启或关闭。研究人员通常使用等温滴定量热法（ITC）来测量蛋白质与DNA结合的强度，但微小的实验问题可能导致结果难以解读。本文提供了一份实用检查清单，帮助研究人员更好地规划ITC实验、发现常见问题，并收集更可靠、可重复的数据。

引言

蛋白质-DNA相互作用是基因调控、基因组组织、发育以及细胞对环境信号响应的核心[1]。由于这些相互作用往往依赖于DNA序列、蛋白质序列、缓冲液条件和结合伙伴浓度的细微变化，可靠的定量测量对于理解结合特异性和机制至关重要[2]。许多实验方法已被用于表征转录因子-DNA结合，

蛋白质表达与纯化

用作代表性蛋白质-DNA结合系统的同源域转录因子构建体在Escherichia coli BL21（DE3）中过表达，并采用His₆-SUMO融合蛋白工作流程进行纯化，如先前所述[13]。培养物在补充有100 μg/mL氨苄青霉素用于筛选的Luria-Bertani培养基中培养，并在优化的表达条件下用异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导。细胞通过离心收获，然后立即进行处理

浓度准确性是可靠ITC拟合的基础

准确的蛋白质和DNA浓度对于可靠的ITC分析至关重要。ITC测量结合过程中释放或吸收的热量，但拟合参数是利用分析时输入的蛋白质和DNA浓度从该热量计算得出的。因此，浓度误差会直接影响拟合的化学计量比、焓和亲和力[8]，[11]。因此，当ITC数据显示出意外的化学计量比、微弱

结论

蛋白质-DNA ITC实验可提供关于结合亲和力、化学计量比、焓和熵的直接定量信息，但这些测量的可靠性取决于严谨的实验设计和故障排查。在本研究中，同源域转录因子-DNA相互作用被用作代表性示例，以突出可能影响ITC数据质量的常见技术问题，包括浓度误差、DNA制备不完整、缓冲液不匹配、差

稿件准备过程中生成式人工智能和AI辅助技术的声明

在本工作准备过程中，作者使用ChatGPT（OpenAI）辅助语言编辑、稿件组织和科学表述的改进。使用此工具后，作者对内容进行了审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

CRediT作者贡献声明

Sarah A. Looby：写作——审阅与编辑、方法论、调查、形式化分析。Lauren N. Merrikin：写作——审阅与编辑、方法论、调查、形式化分析。Fadwa Mekkaoui：写作——审阅与编辑、写作——初稿、可视化、验证、调查、形式化分析、数据整理、概念构思。Donald E. Spratt：写作——审阅与编辑、写作——初稿、监督、项目管理、方法论、调查、资金

利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Donald E. Spratt报告获得了美国国家一般医学科学研究所的财务支持。如果有其他作者，他们声明不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Spratt实验室的现任和前任成员，以及克拉克大学生物学系的Robert Drewell博士和Jacqueline Dresch博士，在本工作开发过程中提供的有益科学讨论和反馈。本工作由美国国家卫生研究院资助（R15GM126432，资助对象为D.E.S.）。

Fadwa Mekkaoui|Sarah A. Looby|Lauren N. Merrikin|Donald E. Spratt