综述：动物研究中应用免疫学方法

《Animal Nutrition》：A review on applying immunological methods in animal research

　　

针对动物营养的研究，包括日粮对免疫系统发育与功能的影响，持续拓展人们对营养免疫学的理解，以改善动物健康与生产性能。本文从哺乳动物和禽类免疫学研究的视角，重点介绍了在实验动物中进行免疫评估时适合物种的方法。强调基础免疫学知识的重要性、注重细节以避免有缺陷的实验，以及在报告和解释结果时保持精确，以避免错误的结论和健康建议。将免疫学方法纳入研究的动物营养学家，必须使用标准化程序、经过验证的工具、适当的对照，并与免疫学家密切合作，以从其研究中获得有效、可靠的免疫学信息。所涉及的主题包括利用外周血分析作为观察全身免疫系统活动的窗口，以及从建立循环白细胞群体谱系到白细胞分离方法及常用功能性检测等系列方法学路径。通过强调哺乳动物与禽类操作程序的差异，研究人员也将意识到在与其他动物物种工作时可能存在的陷阱。例如，鸟类和鱼类的白细胞还包括血栓细胞（thrombocytes），它们可能占白细胞的大多数，但不被视为血液中免疫细胞群体（淋巴细胞、中性粒细胞[鸟类的异嗜性粒细胞]、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）的组成部分。所描述的血液学方法同样适用于组织（如淋巴器官、炎症部位等）中免疫系统相关的研究，包括建立白细胞谱系和分离白细胞用于体外评估。除体外试验外，还讨论了评估体内细胞介导免疫的方法。这些方法包括利用皮肤作为观察复杂组织内反应的窗口。在皮内注射抗原或免疫刺激剂后的特征性皮肤肿胀反应中，特别强调了家禽特有的体内生长羽髓生物测定法，因为它是一种微创操作，能够在无需侵入性外科手术或处死禽类的情况下，对同一个体在不同时间点的局部组织/细胞免疫反应进行评估。总体而言，其目标是帮助营养学家和动物健康研究人员在研究中实施并整合科学合理的免疫学方法和考量，以获取重要见解，从而进一步拓展营养免疫学知识。

1. 引言

本文旨在帮助动物营养领域的研究人员正确应用和解释营养处理对免疫系统发育与功能影响的检测方法。作者基于禽类免疫学同行评审经验，指出哺乳动物、禽类和鱼类营养-免疫研究中常见的方法学错误、信息缺失和结果误读。核心要点包括：了解所研究动物免疫系统的独特性；清楚描述方法、测量和数据转换/表达方式；设置适当对照；精确报告结果并谨慎解释，避免超出研究限度的结论；咨询熟悉目标物种的免疫学家。

2. 利用外周血研究营养对免疫系统的影响

外周血循环是观察免疫系统状态和营养处理调节作用的良好窗口。静脉采血属于微创操作，可对同一个体重复采样。采集样本需使用抗凝剂，抗凝剂选择取决于后续细胞用途，例如吞噬试验应避免使用乙二胺四乙酸（EDTA）。

2.1. 确定白细胞（WBC）图谱

WBC包括淋巴细胞、中性粒细胞（禽类为异嗜性粒细胞）、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。哺乳动物可用自动化血液学分析仪测定各群比例和浓度，但禽类血液因含有血栓细胞而更为复杂。血栓细胞参与凝血，在鸡血液中可占白细胞总数的一半以上，且与淋巴细胞大小相似，会干扰自动区分。人工分类计数需制备Wright或Giemsa染色的血涂片，在油镜下依据形态学特征识别五类WBC并将血栓细胞排除。评估路径也影响结果：沿血涂片边缘观察有利于快速诊断感染，而研究用计数需横穿细胞单层，且至少评估300个WBC。报告时应将分类计数结果明确表述为百分比，且最好结合总WBC浓度计算各群绝对浓度。免疫荧光染色和流式细胞术可进一步区分T、B淋巴细胞亚群，但依赖物种特异性抗体；鸡的商用试剂相对齐全。已有研究建立的全血试验利用CD45和CD41/61双标记，可将WBC鉴定为CD45⁺CD41/61^-群体，将血栓细胞鉴定为CD45⁺CD41/61⁺群体，并通过计数微球获得细胞浓度。

2.2. 全血白细胞分离

哺乳动物可用红细胞裂解缓冲液制备WBC悬液，但禽类红细胞有核，且血液中存在血栓细胞，因此不能简单套用哺乳动物裂解方案，必须验证裂解后细胞悬液的纯度和组成。Ficoll 1077密度梯度离心是哺乳动物和鸡血液中分离外周血单个核细胞（PBMC）的常用方法；哺乳动物PBMC主要为淋巴细胞和单核细胞，而鸡PBMC中还含有大量血栓细胞。可通过粘附特性去除单核细胞和血栓细胞以富集淋巴细胞，也可采用稀释血液慢速离心法获得较纯的外周血淋巴细胞（PBL）。进一步富集和纯化还可使用磁珠分选、补体介导裂解、荧光分选等技术。从淋巴组织和器官中分离白细胞的操作与血液类似，但需注意组织血管中残留血液的污染。所有蛋白检测系统，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和单克隆抗体，都必须验证目标物种特异性。

2.3. 体外和体内细胞介导免疫反应评估

2.3.1. 体外细胞免疫反应测定

体外检测细胞介导免疫通常关注淋巴细胞活化和增殖。抗原特异性T细胞活化需要T细胞受体（TCR）识别抗原呈递细胞（APC）表面与自身主要组织相容性复合体（MHC）结合的抗原肽，且特异性克隆频率较低，检测较为困难。多克隆激活方法如刀豆蛋白A（Con A）和植物血凝素（PHA）常用于评估T细胞增殖能力，但需注意这并不等同于抗原特异性细胞免疫应答；Con A主要激活CD8⁺ T细胞，PHA主要激活CD4⁺ T细胞。抗CD3抗体也可诱导多克隆T细胞活化。混合淋巴细胞反应（MLR）通过同种异体MHC刺激T细胞，单向MLR可用于评估个体细胞介导免疫反应能力。吞噬细胞功能可通过吞噬试验、细胞因子产生及酶活性测定（如NADPH氧化酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶、诱导型一氧化氮合酶等）进行评估；嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞活性可通过脱颗粒释放因子及新合成因子进行检测。

2.3.2. 体内细胞免疫反应测定

组织中的常驻免疫细胞，如树突状细胞（DC）、巨噬细胞和肥大细胞，通过模式识别受体（PRR）识别微生物相关分子模式（MAMP），启动炎症反应并募集血液白细胞。常规组织学和免疫组织化学可提供局部免疫反应信息，但通常需要侵入性采样。迟发型超敏反应（DTH）是广泛应用的体内微创检测方法，通过皮内注射抗原或免疫刺激剂，在24–48小时内测量皮肤肿胀程度，可用于评估个体对测试物的细胞介导免疫反应能力。在禽类中，生长羽髓生物测定利用羽髓作为皮试部位，可对同一只鸡进行多次皮内注射，并在不同时间点采集羽毛进行组织学、流式细胞术、酶活性和基因表达分析，从而无创评估局部和全身免疫反应的动态变化。鸡缺乏IgE，因此不进行I型超敏反应检测。

2.4. 体液免疫评估

体液免疫研究主要检测抗体或免疫球蛋白（Ig）产生，也涉及补体系统、可溶性PRR和急性期蛋白。哺乳动物具有IgM、IgG、IgA和IgE，禽类则具有IgM、IgY（即IgG）和IgA。ELISA是定量总Ig或抗原特异性Ig的常用方法。研究者应明确区分总Ig水平与抗原特异性Ig水平；幼龄动物还需考虑母源抗体的影响。单克隆抗体仅识别单一表位，物种间交叉反应有限，使用前必须验证试剂有效性。抗体反应动力学方面，原发免疫应答中IgM通常在免疫后3–7天出现，随后发生T细胞依赖的类别转换，IgG/IgY水平在7–14天开始上升。建议在免疫后2–4周内重复采血，检测抗原特异性IgM和IgG以观察类别转换，必要时检测IgA和IgE。

2.5. 初级和次级淋巴器官评估

初级淋巴器官包括胸腺和法氏囊；胸腺是哺乳动物和禽类T细胞发育场所，法氏囊是禽类B细胞发育场所。鸡胸腺为多叶结构，采集固定位置的两个胸腺叶可反映胸腺质量变化，称重前需去除附着脂肪。胸腺和法氏囊均随年龄退化，应激和性激素会加速退化。次级淋巴器官如脾脏和淋巴结可用于评估适应性免疫系统状态；鸡没有淋巴结，脾脏是其主要次级淋巴组织。器官重量应结合细胞密度和淋巴细胞亚群比例进行解释。

3. 结论

本综述涉及的免疫学方法范围有限，但所讨论内容为动物营养学家应用免疫学技术提供了方法学框架。可靠研究的开展依赖于对一般免疫学和实验动物免疫系统特异性的理解、正确使用和解释既定测量方法、以精确方式报告方法和结果、设置正确对照，并与免疫学专家保持沟通。这些高质量数据将推动营养免疫学的发展，并为营养与育种方案及动物健康管理提供依据。