应激颗粒拮抗作用对SARS-CoV-2感染及致病机制至关重要

《Journal of Virology》：Antagonism of stress granules is key to SARS-CoV-2 infection and pathogenesis

　　

病毒必须破坏宿主反应以建立成功感染。虽然大多数抗病毒反应与干扰素（interferon, IFN）相关，但应激颗粒（stress granules, SGs）通过诱导翻译停滞构成病毒感染的又一屏障。为对抗SG活性，病毒已进化出破坏这些复合物形成及解聚的机制。研究人员先前的研究确定了SARS-CoV-2 NSP3（Y138/F145）和核衣壳蛋白（N）（F17）中可独立拮抗SG活性的残基。破坏NSP3或核衣壳蛋白中的这些关键残基可减弱病毒复制，但对体内致病性影响有限，表明SG拮抗作用的重叠部分补偿了各自的缺失。本研究中，研究人员评估了同时含有NSP3和N突变的SARS-CoV-2突变体（YF/F17A）。研究发现，丧失两种SG拮抗功能可在体外减弱SARS-CoV-2复制。虽然I型干扰素敏感性未见改变，但减毒与SG诱导增加相对应。重要的是，SARS-CoV-2 YF/F17A突变体在体内显著减毒，表现为病毒复制减少、体重下降减轻及免疫病理有限。值得注意的是，YF/F17A突变体感染所刺激的干扰素和炎症反应较少。尽管宿主反应减弱，YF/F17A突变体仍诱导了针对后续野生型（WT）SARS-CoV-2攻击的强效保护。总体而言，该研究凸显了SG控制对SARS-CoV-2感染的重要性，并为未来的疫苗接种和治疗方法提供了新的、不依赖干扰素的靶点。

**研究背景**

冠状病毒（Coronavirus, CoV）为正义单链RNA包膜病毒，本世纪已导致三次全球性大流行，对全球公共卫生构成严重威胁。宿主细胞在遭遇病毒感染等应激时，通过应激激活激酶迅速破坏真核翻译起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F, eIF4F）复合物形成，使未翻译mRNA与宿主蛋白聚集形成胞浆灶点，即应激颗粒（stress granules, SGs）。SGs是通过液-液相分离形成的瞬时核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）凝聚体，包含停滞的翻译前起始复合物、细胞mRNA、小核糖体亚基及Ras GTP酶激活蛋白结合蛋白1（Ras GTPase-activation protein-binding 1, G3BP1）、脆性X智力低下蛋白（Fragile X mental retardation protein, FMRP）等RNA结合蛋白。病毒需破坏或延缓SG形成，以确保宿主翻译机器持续合成病毒蛋白。研究人员前期发现SARS-CoV-2非结构蛋白3（nonstructural protein 3, NSP3）高变区（hyper-variable region, HVR）中Y138/F145残基通过与泛素相关蛋白2样蛋白（ubiquitin-associated protein 2-like, UBA2PL）结合进而作用于FMRP相关蛋白来拮抗SG活性，而核衣壳蛋白（nucleocapsid, N）F17残基通过结合G3BP1的NTF2L结构域解聚SG。单独破坏上述任一界面仅导致中度减毒，提示两条SG拮抗通路存在功能重叠。为检验同时消除两条通路的影响，研究人员构建了NSP3及N双突变病毒YF/F17A，以阐明SG控制对SARS-CoV-2感染及致病的关键作用。该研究发表于《Journal of Virology》。

**主要技术方法**

研究人员采用反向遗传学系统（reverse genetics）在SARS-CoV-2 WA-1株骨架上引入NSP3-Y138A/F145A（YF）及N-F17A双突变，经Sanger测序验证后获得P1病毒株。体外实验选用Vero E6（I型干扰素缺陷细胞）、Calu3（人支气管上皮细胞）及A549-ACE2（表达人ACE2的肺腺癌细胞系）三种模型。体内实验采用3-4周龄雄性叙利亚金黄地鼠（购自Envigo公司），经鼻接种10⁵蚀斑形成单位（focus-forming unit, FFU）病毒。关键技术包括免疫荧光显微镜检测G3BP1灶点、亚砷酸钠诱导SG实验、I型干扰素预处理试验、RT-qPCR基因表达分析、肺组织病毒蚀斑形成试验（focus-forming assay, FFA）、H&E染色及免疫组化、Poly(A)-ClickSeq转录组测序及空斑减少中和试验（focus reduction neutralization test, FRNT₅₀）。

**研究结果**

**1. 破坏NSP3和N的应激颗粒拮抗作用可减弱SARS-CoV-2感染**

在感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.01的条件下，YF/F17A突变体在Vero E6、Calu3及A549-ACE2细胞中的复制均显著低于野生型（wild-type, WT）病毒。Calu3细胞中YF/F17A在24 hpi未检测到病毒，48 hpi滴度较WT低3个对数数量级，表明双重突变导致体外复制显著减毒。

**2. YF/F17A突变体减毒并非主要由I型干扰素应答介导**

100 U重组I型干扰素预处理后，YF/F17A与WT均仅表现约1个对数滴度下降，未出现干扰素高敏感突变体典型的>3个对数衰减。高MOI感染A549-ACE2后，干扰素相关基因（IFNB1、IFIT1、IFIT3、OAS1、MDA5、PKR）表达在WT与YF/F17A间基本无差异，甚至IFNβ在WT感染中更高，证实减毒与固有免疫增强无关。

**3. YF/F17A突变体复制减少与高水平应激颗粒形成相关**

免疫荧光检测显示，WT感染细胞在各时间点均不形成G3BP1灶点，而YF/F17A感染细胞在10及24 hpi出现显著N蛋白与G3BP1双阳性信号，24 hpi约25%以上细胞呈SG阳性（WT组<3%）。

**4. YF/F17A突变体无法逆转亚砷酸盐诱导的应激颗粒**

亚砷酸钠处理后，WT感染细胞中N阳性细胞缺乏G3BP1灶点，而YF/F17A感染细胞中N与G3BP1双阳性比例在10及24 hpi均显著升高，说明突变体丧失主动清除SG的能力，且随感染进程N阳性细胞数减少。

**5. YF/F17A突变体在体内显著减毒**

金黄地鼠模型中，YF/F17A感染组体重下降较WT组显著减轻（WT组峰值约15%，突变体组维持初始体重无明显疾病体征）。肺组织病毒滴度在2天感染（days post-infection, DPI）降低1个对数、4 DPI降低2个对数，而鼻洗液滴度与WT无差异，提示上呼吸道复制不受影响。

**6. YF/F17A突变体感染后宿主免疫应答减弱**

肺组织H&E染色和N抗原免疫组化显示，突变体感染组免疫浸润及炎症较WT组显著减少，且消退更早。转录组测序显示4 DPI时WT与YF/F17A间有3,721个差异表达基因；基因本体（gene ontology, GO）分析表明，YF/F17A组中先天免疫应答、炎症反应及细胞因子/趋化因子相关通路基因表达下调，直接比较显示免疫相关基因簇在突变体组表达均低于WT。

**7. YF/F17A突变体感染可保护动物抵御SARS-CoV-2再攻击**

初次感染21天后以WT病毒再攻击，YF/F17A免疫组与WT免疫组均无体重下降，肺组织病毒阴性，抗原染色及H&E病理评分极低，仅鼻洗液存在少量可检出的病毒但滴度显著低于未免疫对照组。中和抗体检测显示两组FRNT₅₀滴度相近，对WA.1及Omicron BA.5变异株均具相似中和活性。

**讨论与结论**

讨论部分指出，NSP3在感染早期（10 hpi前）通过结合FMRPs延缓SG形成，而N在感染晚期（10 hpi及以后）通过结合G3BP1/2解聚SG，二者构成时间上互补的SG控制网络，说明SARS-CoV-2投入大量遗传资源控制SG。YF/F17A减毒与SG积累相关而非固有免疫增强，提示SG可通过隔离病毒RNA等机制限制感染而不激活干扰素通路，先天免疫信号在此过程中未被放大。该发现为研发不依赖I型干扰素的减毒活疫苗提供了新策略——即靶向SG拮抗作用。F17残基在SARS-CoV及Sarbecovirus家族中保守，而NSP3-HVR基序仅见于Sarbecovirus；其他CoV家族采用不同机制（如MERS-CoV ORF4a）拮抗SG，表明控制SG是冠状病毒共同的进化需求。此外，靶向N-G3BP1与NSP3-FMRP相互作用的药物联用策略具有广谱抗CoV治疗潜力。YF/F17A突变体因其复制能力保留、不诱导固有免疫通路且SG诱导显著增强，也可作为研究病毒感染免疫背景下SG功能的工具病毒。

结论：丧失NSP3和N阻断SG形成的机制可使SARS-CoV-2突变体在体内外显著减毒。该减毒与突变体中SG显著激活及较WT降低的固有免疫激活相关，最终表现为病毒复制减少和体内疾病减轻。研究结果凸显了N与NSP3双重SG拮抗的重要性，并将靶向SG拮抗作用确立为冠状病毒减毒和治疗的新途径。