《Journal of Virology》：African swine fever virus pMGF110-9L plays a critical role in the integrated stress response and viral pathogenesis
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非洲猪瘟病毒（ASFV）是非洲猪瘟（ASF）的病原，ASF是一种在家猪和野猪中高度传染且常致死的点状出血性疾病，对全球生猪产业构成重大威胁。为保障成功复制，ASFV可能调控细胞应激机制以劫持宿主翻译机器，并促进病毒工厂形成，从而有利于病毒蛋白合成并拮抗宿主防御
非洲猪瘟病毒（ASFV）是非洲猪瘟（ASF）的病原，ASF是一种在家猪和野猪中高度传染且常致死的点状出血性疾病，对全球生猪产业构成重大威胁。为保障成功复制，ASFV可能调控细胞应激机制以劫持宿主翻译机器，并促进病毒工厂形成，从而有利于病毒蛋白合成并拮抗宿主防御。然而，ASFV复制与细胞应激反应之间的相互作用尚未阐明，阻碍了疫苗或治疗选项的研发。研究人员在本研究中剖析了ASFV如何操纵整合应激反应（ISR）以促进病毒复制，并鉴定出毒力相关因子pMGF110-9L是ATF4表达的最强激活因子，ATF4是eIF2α磷酸化后ISR激活通路中的关键下游因子。研究人员将pMGF110-9L表征为一种内质网（ER）定位的膜蛋白，其表达深刻重组细胞区室，导致ER肿胀与聚集。进一步蛋白质组学分析与生化实验显示，pMGF110-9L对ASFV诱导的ER应激至关重要，并促进未折叠蛋白反应（UPR）的PERK-eIF2α-ATF4、IRE1α-XBP1与ATF6分支激活。具体来讲，研究人员证明pMGF110-9L通过PERK/PKR-eIF2α通路激活ISR，导致病毒接管蛋白合成机器，伴随全局蛋白合成停止与应激颗粒形成。此外，pMGF110-9L的跨膜结构域对于靶向ER及后续应激反应不可或缺。总体而言，这些发现为ASFV–宿主互作提供了新见解，并界定了pMGF110-9L在ASFV致病机制中此前未被表征的作用。
研究背景方面，非洲猪瘟（ASF）由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起，在急性与超急性形式下病死率接近100%，2018年传入中国后影响全球过半生猪种群，现有手段主要依赖扑杀与生物安全，安全有效疫苗稀缺。ASFV为细胞质大DNA病毒，多重基因家族（MGF）与毒力和免疫逃逸相关，但ASFV复制与细胞应激反应互作不清。整合应激反应（ISR）通过PERK、PKR、HRI、GCN2四类激酶使eIF2α第51位丝氨酸（S51）磷酸化，降低全局翻译并优先翻译ATF4；内质网（ER）是ASFV病毒工厂形成与成熟的重要场所，ER应激和未折叠蛋白反应（UPR）可被ASFV利用，但哪些病毒蛋白主导该过程仍不明确。研究人员因此开展全基因组尺度筛选，定位最强ISR激活蛋白并解析机制。
该论文发表于《Journal of Virology》。
关键技术方法方面，研究人员使用HEK293T、PK-15、3D4/21及原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）等细胞模型，以及ASFV野生型CN/GS/2018与MGF110-9L缺失突变株ASFV-Δ9L；以ATF4荧光素酶报告系统作全基因组筛选，结合ER分离、透射电镜（TEM）、结构光照明显微镜（SIM）、共聚焦免疫荧光、免疫共沉淀、Western blot、RT-qPCR、核糖体嘌呤霉素标记（ribopuromycylation）翻译效率检测、特异性激酶抑制剂与siRNA敲低等功能验证。
研究结果如下。
Luciferase-based genome-wide screening of ASFV-encoded ISR modulators：研究人员用ATF4-Rluc报告系统在HEK293T中表达151个ASFV开放阅读框，发现17个蛋白使ATF4-Rluc活性提升超过2.5倍，9个蛋白抑制超过2.5倍；pMGF110-9L为最强激活因子，早期蛋白多激活ISR，晚期蛋白如pDP71L多抑制ISR。
ASFV pMGF110-9L robustly induces the phosphorylation of eIF2α and activates the ISR：研究人员在PK-15、3D4/21异位表达pMGF110-9L，发现其剂量依赖性升高p-eIF2α与ATF4蛋白及ATF4、CHOP mRNA；PAMs感染实验中，ASFV-Δ9L较野生型显著降低p-eIF2α、ATF4及ATF4、CHOP转录水平，证明pMGF110-9L促进eIF2α磷酸化与ISR信号。
ASFV pMGF110-9L induces ER swelling and an abnormal ER morphology：生物信息学预测与DsRed2-ER共定位、ER分离及TEM、SIM显示，pMGF110-9L为ER定位膜蛋白，含跨膜结构域，表达后引起ER肿胀、管状ER向聚集体转变及高尔基体相关蛋白异常转运。
ASFV pMGF110-9L induces ER stress and triggers the activation of three UPR pathways：蛋白质组学提示其与ER蛋白加工、钙信号和ATP代谢相关；研究人员证实其与BIP、calreticulin、PDI互作并升高BIP。异位表达增强p-PERK、p-IRE1α与ATF6p50，提升Xbp1s、EDEM1、P58IPK、ERdj4、Calreticulin转录；感染模型中MGF110-9L缺失削弱BIP、p-PERK、p-IRE1α与ATF6p50活化，表明其驱动PERK-eIF2α-ATF4、IRE1α-XBP1、ATF6三分支UPR。
ASFV pMGF110-9L activates the ISR through the PERK/PKR-eIF2α pathway：研究人员发现pMGF110-9L升高p-PKR而非p-GCN2；PERK抑制剂GSK2606414、PKR抑制剂C16及siPKR均可削弱p-eIF2α，结论为其通过PERK与PKR双通路激活ISR。
ASFV pMGF110-9L inhibits cellular translation in an eIF2α phosphorylation-dependent manner：Rluc与核糖体嘌呤霉素标记显示，pMGF110-9L在翻译水平抑制宿主蛋白合成，ISRIB可恢复全局翻译；ASFV-Δ9L感染PAMs后宿主翻译抑制减轻，说明该抑制依赖eIF2α磷酸化与ISR。
ASFV pMGF110-9L triggers SG formation in an eIF2α phosphorylation-dependent manner：以G3BP1标记应激颗粒（SG）显示，pMGF110-9L使约25%细胞形成SG，ISRIB或pDP71L可抑制；野生型ASFV感染PAMs在4–8 hpi出现短暂SG波，ASFV-Δ9L早期SG更少，说明其贡献于早期短暂eIF2α磷酸化相关SG，后被晚期病毒拮抗因子抵消。
TM domain of ASFV pMGF110-9L is critical for cellular translational shutdown and SG formation：构建截短体后发现，缺失跨膜结构域的片段不再定位于ER，也无法有效诱导p-eIF2α、ATF4、全局翻译停止与SG形成；含跨膜结构域片段保留功能，证明跨膜结构域对ER定位、ISR激活、翻译关闭与SG形成不可或缺。
讨论部分总结：研究人员指出ASFV采用双相翻译操控策略，早期由pMGF110-9L等激活PERK/PKR-eIF2α引发宿主翻译关闭与病毒接管，晚期由pDP71L等使eIF2α去磷酸化以恢复全局翻译并大量合成结构蛋白。pMGF110-9L通过ER肿胀、聚集体和UPR塑造复制有利环境，并可能干扰SLA I相关抗原呈递。MGF110家族在不同基因型中可缺失或重排，故pMGF110-9L的贡献具有毒株背景依赖性，但不是巨噬嗜性与基础毒力的核心决定因子。该蛋白可作为改良活疫苗（MLV）候选靶标。
研究结论部分翻译：ISR代表病毒感染后重要的细胞反应，可指导翻译重编程并触发SG组装、自噬、免疫调节等过程。研究人员系统评估了全部ASFV编码蛋白对ISR的影响，鉴定pMGF110-9L为ATF4表达层面最强ISR激活因子。pMGF110-9L是ER定位膜蛋白，可引起ER肿胀与异常形态、激活PERK-eIF2α-ATF4、IRE1α-XBP1与ATF6分支UPR，并通过PERK/PKR-eIF2α通路降低全局蛋白合成、诱导SG形成；其跨膜结构域对ER定位与ISR激活不可或缺。多种早期蛋白可诱导eIF2α磷酸化，但单独缺失MGF110-9L即在感染背景下明显削弱ISR/UPR、翻译关闭与SG形成，证明其具非冗余作用。综上，pMGF110-9L是关键毒力相关因子，参与病毒蛋白合成机器接管、ER应激、ER相关聚集体形成、宿主翻译停滞与SG形成，是ASFV致病机制中的新型效应蛋白，也是MLV疫苗开发的有吸引力靶点。
