呼吸道过敏影响着全球超过5亿人口，构成了重大的公共卫生挑战。草花粉（GP）是过敏性呼吸道疾病的重要诱因，包括过敏性鼻炎（AR）、季节性过敏性哮喘，尤其是大规模雷暴哮喘（TA）事件。诱导对花粉产生过敏性致敏的先天性和适应性免疫通路之间的复杂相互作用仍知之甚少。半胱氨酸蛋白酶（CPs）是在一系列气传变应原来源中发现的酶，包括屋尘螨（HDM）的粪便物质和花粉。这些酶能够破坏上皮屏障的完整性，因此是HDM变应原性的促成因素，也可能参与GP变应原性。然而，以往的研究主要集中在HDM来源的CPs上。本文采用叙述性综述方法和生物信息学分析，比较了来自GP和HDM的CPs的变应原特性，并探讨了花粉来源的CP如何可能诱导过敏性致敏。主要发现表明，已鉴定的豚草属（Ambrosia属；Amb a 11；Amb t CP）和百慕大草（Cynodon dactylon；Cyn d CP）的花粉来源CP变应原，来源于由不同基因位点编码的不同生化CP蛋白亚家族。针对Amb t CP和Cyn d CP的特异性IgE（sIgE）反应性尚未在其他相关患者群体或国际免疫学会联合会（IUIS）变应原命名委员会中得到验证。花粉来源CP的变应原性可能因气候变化等环境修饰因素以及与花粉相关的微生物组而增强。了解花粉变应原与气道上皮的相互作用对于理解GP启动和加剧气道炎症的机制至关重要。然而，目前支持CPs作为GP内变应原的证据有限，并且探索花粉CP在驱动过敏性炎症过程中作用的机制性研究很少。
2. 关于半胱氨酸蛋白酶变应原性的已知知识
2.1. 屋尘螨来源的半胱氨酸蛋白酶
Der p 1属于木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（PLCP）蛋白家族，并表现出蛋白水解活性。这种蛋白水解活性可通过切割紧密连接蛋白来破坏鼻腔和气道上皮粘膜屏障，导致气道黏膜通透性增加，促进变应原渗透到上皮下层，从而可能增强免疫激活和过敏性致敏。HDM的蛋白质变应原集中在螨虫粪便颗粒中，其中变应原组1、2和23在致敏个体中显示出超过70%的IgE结合频率。Der p 1提供了一个蛋白酶驱动的过敏性致敏的成熟模型。通过其酶功能，Der p 1激活上皮细胞上的蛋白酶激活受体（PAR），如PAR1和PAR4，进而调节Toll样受体4（TLR4）信号通路。与此一致，Der p 1暴露可导致CD4+ T细胞分化为2型辅助T细胞（Th2）并产生2型细胞因子。Der p 1还通过TLR4依赖性机制参与树突状细胞的活化。此外，它通过蛋白水解切割免疫调节分子来促进IgE的产生。重要的是，即使在与IgE结合时，Der p 1仍能保持酶活性，使其能够触发IgE依赖性和IgE非依赖性的免疫通路。
2.2. 花粉来源的半胱氨酸蛋白酶：当前认识
根据IUIS变应原命名分类标准，一种蛋白质必须至少在5名有症状的患者中显示出IgE反应性，才能被正式认定为变应原。来自百慕大草（Cynodon dactylon）花粉的Cyn d CP是报道最早的花粉来源CP变应原。其鉴定基于通过免疫印迹法检测花粉外壳蛋白所观察到的IgE反应性，其中七名百慕大草花粉过敏患者中有四名呈阳性。然而，缺乏非特应性对照组限制了对其临床相关性的确认。值得注意的是，这种IgE反应性是通过天然花粉外壳蛋白提取物而非重组Cyn d CP进行表征的。该变应原尚未得到IUIS变应原命名委员会的验证。通过体外多形核细胞穿过呼吸道上皮单层的迁移实验以及促炎细胞因子（IL-6、IL-8和IL-17）的诱导，以及使用百慕大草花粉外壳蛋白在小鼠体内进行鼻内致敏实验，证明了其功能性变应原性。
Amb a 11是一种来自豚草（Ambrosia artemisiifolia）花粉的CP，是目前特征最明确的花粉来源CP。Bouley等人（2015年）通过斑点印迹分析和蛋白质印迹分析分别证明，在67名美国和欧洲AR患者中有44名（65%）以及在92名过敏个体中有50名（54%）存在针对Amb a 11的血清IgE反应性。Amb a 11的功能性变应原性得到了使用5名致敏患者血液进行的嗜碱性粒细胞活化试验的支持。Amb a 11基于在多名有症状个体中识别出的IgE而符合IUIS变应原命名标准。另外，通过ELISA方法，在来自罗马尼亚的150名成年呼吸道过敏患者中，有102名（68%）显示出针对重组Amb a 11的特异性IgE反应性。然而，尽管该ELISA检测中的阳性反应是基于高于阴性对照平均值三个标准差的标准，但在44名参与者中只有三人对重组Amb a 11检测呈阳性。此外，当Amb a 11被生物素化并用于链霉亲和素ImmunoCAP检测时，这些样本显示出低浓度的特异性IgE。
在中国，巨豚草（Ambrosia trifida）花粉中也描述了一种类似的CP变应原（Amb t CP），该植物的流行程度正在逐渐增加。通过ELISA、免疫印迹法以及在一名患者中进行的嗜碱性粒细胞活化试验证实，成熟的Amb t CP在23名豚草过敏患者中有11名（47%）显示出特异性IgE反应性。然而，该CP尚未被IUIS变应原命名委员会命名为变应原。
2.3. 关于花粉半胱氨酸蛋白酶变应原性的局限性与不确定性
二十多年前就已证明，来自六种植物物种（黑麦草、肯塔基蓝草、百慕大草、西部豚草、白桦和悉尼金合欢）的水合花粉提取物在体外具有蛋白水解活性，但所涉及的分子未被鉴定出来。由于大多数花粉提取物通常使用水性缓冲液而非完整花粉粒，因此可能在禾本科和其他花粉的变应原谱系中遗漏了对假定花粉来源CP变应原的鉴定。Bashir等人（2013年）指出，对花粉粒进行脱脂处理会去除IgE反应性表面蛋白，这为其他研究未能在GP中鉴定出CP提供了一个潜在的解释。
桉树和藜属物种的花粉来源丝氨酸蛋白酶已被证明可通过蛋白水解降解紧密连接蛋白来改变肺上皮的完整性，这与HDM来源的CP类似。虽然Amb a 11的蛋白水解活性已在各种pH条件下进行了表征，但其在生理性气道表面（pH 7.4）下的活性，或针对体外气道上皮靶标的活性尚未被评估。百慕大草花粉外壳来源CP（Cyn d CP）的蛋白水解活性仅通过在体外实验中使呼吸道上皮细胞从玻璃片上脱落来证明。因此，花粉来源CP在生理条件下的蛋白水解活性以及对上皮细胞紧密连接的破坏作用是一个关键的知识空白。
虽然Amb a 11满足至少5名过敏患者的最低阈值，但Cyn d CP和Amb t CP仍有待IUIS变应原命名委员会指定变应原名称。此外，针对Amb t CP和Cyn d CP的血清特异性IgE反应性尚未在其他临床相关人群中得到独立重复。总的来说，这些发现揭示了在花粉来源CP的鉴定与其免疫致病作用之间存在巨大的证据差距。
3. 半胱氨酸蛋白酶的生化特性
3.1. 半胱氨酸蛋白酶生化家族层级
CPs是属于较大组织蛋白酶组的一类多样化的蛋白水解酶。组织蛋白酶在细胞过程（包括炎症和免疫反应）中发挥关键作用。基于其活性位点机制，组织蛋白酶分为三大催化家族：丝氨酸蛋白酶（38种已知变应原）、天冬氨酰蛋白酶（5种已知变应原）和半胱氨酸蛋白酶。CPs代表了组织蛋白酶的一个主要子集，包括12种公认的变应原蛋白。CPs利用半胱氨酸-组氨酸催化机制，可以在广泛（主要为酸性至中性）的pH环境中发挥作用，从而实现更大的功能多样性。它们是一组生化和分类学上多样的酶，这一特性对其在不同气传变应原来源中的变应原性和功能行为具有影响。在更广泛的分类学层面上，CPs被组织成10个部落（CA、CB、CC、CD、CE、CF、CL、CM、CN、CO），包含113个家族，编号从C1到C124。这种层级结构反映了CPs在物种和组织间的结构和功能多样性及其专门作用。
在PLCPs（部落CA，家族C1）中，有一些特征最明确的CPs，包括12种花粉、螨虫、昆虫和食物变应原。PLCPs的特征在于一个前蛋白被切割形成成熟肽，并带有一个由半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺组成的催化三联体。花粉来源CP的PLCP例子包括Amb a 11，其催化三联体位于Cys47、His181和Asn202位置；以及Cyn d CP，其催化三联体位于Cys26、His159和Asn181位置。这些酶执行共价催化，其中半胱氨酸作为亲核试剂攻击底物的可裂解键，导致去蛋白化并切割N端和C端前肽。催化作用是pH依赖性的，底物结合裂隙的变化控制着活化。天冬酰胺残基在增强半胱氨酸的亲核性方面起着至关重要的作用，有助于在底物切割过程中形成羧酸部分。这些机制，包括通过亚细胞定位进行的pH调控，确保了靶向蛋白水解。
PLCPs由四个组织蛋白酶组组成：CtL、CtB、CtF和CtH，其中CtL样组最多样化。特定的结构特征区分了这些亚家族；例如，ERFNIN基序影响N端前结构域的折叠，该结构域包含三个α-螺旋和一个阻断活性位点的β-链。这些结构基序和结构域对于调控蛋白酶活性至关重要。
对于Der p 1，其前结构域通过竞争性蛋白水解发生快速降解，同时变应原达到最大效力。Soh等人（2023年）提出，蛋白酶变应原（如Der p 1或Amb a 11）可作为起始变应原，促进过敏反应的发作。组织蛋白酶可以激活炎症小体并促进细胞因子成熟，这表明它们在免疫监视和炎症中的重要性。具体而言，组织蛋白酶B、C、S、L和Z通过激活诸如NLRP3等炎症小体或通过溶酶体膜透化作用介导炎症反应，这可能导致促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟。虽然HDM Der p 1激活PAR-2，并通过蛋白水解切割炎症受体以促进白细胞介素6的产生，但目前尚不清楚花粉来源的CPs是否参与类似的炎症小体激活机制。这些生化特性为潜在的变应原性提供了机制基础，但不能确认其临床相关性。
3.2. 半胱氨酸蛋白酶变应原之间的关系
尽管将变应原性CPs归入生化亚家族仍未得到确认，但对已知变应原性CPs的生物信息学分析表明其具有不同的功能性蛋白水解活性。WHO/IUIS变应原命名小组委员会建议，共享至少67%氨基酸序列同一性的蛋白质应在同一变应原来源内归类为相同的变应原组。此外，氨基酸序列同一性以及CP的Gly-His-Asn催化三联体的特征已被用于识别PLCP蛋白亚家族分组。Amb a 11和Cyn d CP具有42%的氨基酸同一性，似乎属于不同的CP生化亚家族。然而，同属豚草属的CPs：Amb a 11和Amb t CP，具有97%的氨基酸同一性，表明假定的Amb t CP极有可能与Amb a 11归属于同一个CP生化亚家族。相比之下，从系统发育分支来看，Cyn d CP的分支长度为0.53和0.52，表明尽管在该树中系统发育关系较近，但它们可能属于CtL样组内的不同亚家族。
Der p 1和Der f 1享有84%的氨基酸同一性。同样，Der f CtB3样CP和Der p CtB3样亚家族的比对显示76%的氨基酸同一性。在不同基因位点编码的、具有特定基序和结构域结构的独特CtB3样CPs表明其表达受到差异性调控。这些差异指示了可能的生化亚家族分化，支持使用亚家族分类作为CP分类中的一个有意义的标准。大多数已知变应原已得到变应原命名委员会的验证，并在《分子变态反应学用户指南》中系统总结或在allergen.org网站上索引。已知CP变应原的多重蛋白质序列比对显示了其生化多样性，强调了亚家族分类对于解释变应原结构和功能的重要性。
4. 气传变应原半胱氨酸蛋白酶诱导炎症的机制
4.1. 致敏过程概述
全球AR患病率持续上升。在澳大利亚，估计分别有23.8%和11.0%的人口患有AR和哮喘。阐明花粉过敏性致敏的分子和细胞机制仍然至关重要。
对环境变应原的过敏性致敏通常始于黏膜表面（如呼吸道），并且是变应原特异性的。它涉及Th2适应性免疫通路的激活，该通路产生促进IgE抗体产生的细胞因子，并在后续变应原暴露时使免疫系统为即时的IgE介导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞反应做好准备。因此，这个致敏阶段是由影响Th2极化的上皮和先天免疫信号事件塑造的。花粉来源的CP变应原已被提议作为该致敏过程中的候选起始分子。
4.2. 黏膜上皮屏障处的初始致敏
过敏性致敏源于变应原与环境辅助因子（如变应原微生物组）之间的相互作用，通过先天免疫受体，导致适应性免疫反应的发展。这个早期致敏阶段的典型特征是上皮源性警报素的释放，包括胸腺基质淋巴细胞生成素、IL-25和IL-33。这些警报素启动涉及2型先天淋巴样细胞（ILC2）的信号通路，并促进初始T细胞极化为Th2细胞。初次气传变应原暴露会引起白细胞浸润到黏膜组织，导致炎症。
另一种变应原性机制涉及蛋白酶激活受体，这是G蛋白偶联受体的一个亚家族。它们在调节免疫反应中发挥关键作用。由内源性或外源性蛋白酶通过蛋白水解切割激活后，一个束缚配体被暴露，导致PAR的激活。PAR激活还会破坏上皮紧密连接，增加通透性和变应原渗透，促进变应原进入树突状细胞，并调节气道的免疫和结构细胞功能，从而启动过敏性致敏。这会触发Th2信号传导并诱导适应性免疫反应。
值得注意的是，植物来源分子对PARs和其他GPCRs的激活也可以以IgE非依赖的方式诱导肥大细胞脱颗粒，导致具有相似临床症状的假性过敏反应。此外，Th2炎症期间的IL-13产生可以在没有TCR刺激的情况下发生，而像金黄色葡萄球菌这样的细菌可以通过TLR2以IgE非依赖的方式激活肥大细胞。因此，包括PAR2在内的PARs似乎在过敏反应的启动和放大中都起着核心作用，但尚不清楚花粉来源的生物分子（如花粉来源的CPs）是否能在体内激活这些通路。
4.3. 上皮下通路
上皮下的树突状细胞在上皮下层处理吸入的变应原，并将这些变应原运输到引流淋巴结，与初始CD4+ T淋巴细胞相互作用。通过MHC II复合物将变应原呈递给T细胞受体，经典的树突状细胞激活初始CD4+淋巴细胞，后者在IL-4刺激下分化为Th2细胞。此外，过敏反应期间IgE对呼吸道上皮下的影响最近已由Domingo等人进行了综述。这些上皮下通路表明，IgE通过变应原跨上皮屏障转运至气道腔黏膜下结缔组织的机制直接影响气道上皮细胞。
T细胞和B细胞之间的相互作用促进了免疫球蛋白类别转换为IgE，主要在引流淋巴结的生发中心进行，驱动变应原特异性记忆IgE B细胞的成熟及其分化为浆细胞。一些变应原，包括HDM来源的CPs，具有内在的蛋白酶活性，可以破坏上皮屏障，允许更深层的组织渗透并引起直接炎症，以及随后的IgE介导的过敏反应。通过突破上皮屏障，CP变应原促进先天免疫激活，从而导致抗原呈递以及驱动IgE类别转换的T细胞-B细胞相互作用。这些T细胞-B细胞相互作用为潜在的CP过敏性致敏和IgE介导的Th2反应提供了进一步的机制见解。
4.4. 效应阶段
后续的过敏反应涉及再次暴露于吸入的气传变应原时立即发生的IgE介导的炎症级联反应。气传变应原通过与组织驻留肥大细胞上高亲和力FcεR1受体的特异性IgE结合来驱动过敏性炎症，这个过程诱导受体交联，触发脱颗粒并立即释放炎症介质，如组胺、蛋白酶、脂质介质和细胞因子。尽管对这些既定过程有所了解，但花粉来源CP在驱动过敏性致敏中的作用仍不清楚。
4.5. 相关的过敏性呼吸道疾病
过敏性呼吸道疾病如AR和哮喘会损害健康和睡眠，导致显著的医疗保健成本，并造成生产力损失。大约80%的哮喘患者表现出AR症状，10-40%的AR患者伴有哮喘。AR的其他合并症包括过敏性结膜炎、干咳、咽鼓管功能障碍和慢性鼻窦炎。季节性过敏性哮喘患者短期接触GP可导致嗜酸性粒细胞气道改变和肺功能下降。此外，同时接触GP和病毒感染可能会削弱抗病毒免疫反应。在特定的气象条件下，这种花粉驱动的气道反应有可能升级为严重的哮喘急性发作，正如在流行级别的TA事件中所观察到的那样。因此，AR是一个重要的社会经济问题，影响了四分之一的澳大利亚人，且其患病率在全球范围内不断增加。
TA是一种突然的、严重的哮喘急性发作，由气象和环境条件（包括高浓度GP暴露）共同触发，发生在先前对GP致敏的个体中。完整的GP颗粒通常范围为25-45 μm，存在种间差异。这些颗粒通常在吸入时沉积在上呼吸道黏膜。伴有强冷阵风和闪电的雷暴可以促进GP颗粒破裂，导致亚花粉颗粒和淀粉颗粒的释放。这些释放的成分足以穿透下呼吸道；因此，这些SPPs有可能触发过敏性炎症的发生。总之，这支持了一个假设，即可吸入的花粉来源生物分子在TA事件期间直接促进了过敏性呼吸道疾病的恶化。
云对云闪电和GP暴露已被证明与亚热带地区哮喘就诊的增加有关。在雷暴期间，据信花粉由于渗透压休克而破裂并向大气中释放SPPs。有人提出，闪电可能使这些颗粒带电并进一步碎裂，增加其可吸入潜力。虽然IgE介导的作用很可能参与其中，但这并不排除GP的其他直接作用，包括像花粉来源CP这样的生物分子参与驱动气道炎症。已经假设，雷暴期间SPPs的机械碎裂可能改变花粉变应原构象，对变应原性具有潜在影响。然而，此类效应的方向、幅度和生物学相关性仍有待确定，并且尚未通过实验证明其对CP的直接作用。最近的证据表明，雷暴条件下的电荷可以诱导黑麦草花粉破裂并增强SPP的产生，从而增加空气中变应原的可用性。值得注意的是，虽然花粉中存在的蛋白酶先前已被证明会损害气道上皮屏障，但目前的文献没有提供花粉CP在SPPs中活性的证据，这代表了该假设中的一个重要空白。
TA预警仅存在于澳大利亚维多利亚州，那里频繁发生TA事件，但其他司法管辖区也有TA发作的情况，例如澳大利亚首都领地和新南威尔士州。此外，针对温带GP组5变应原的特异性IgE，该变应原存在于花粉淀粉颗粒中，已被认为与TA和气道炎症有关。值得注意的是，亚热带GP不含有禾本科组5变应原，但亚热带GP暴露仍与哮喘急性发作相关，这表明组5变应原并非GP触发哮喘的唯一或必需分子，暗示GP在启动和加剧气道炎症中必定存在额外或替代的作用机制。亚热带GP确实含有主要的GP组1变应原；例如Pas n 1和Cyn d 1，它们能引发特异性IgE反应性，并可能在亚热带地区GP过敏患者中驱动过敏性炎症。理解所涉及的机制对于解释GP诱导的气道炎症至关重要，并强调了更广泛地提供早期预警系统以减轻GP和雷暴诱发的哮喘急性发作的必要性。
5. 呼吸道过敏的微生物和环境驱动因素
5.1. 植物免疫与微生物免疫的相互作用
虽然植物不具备适应性免疫系统，但它们依赖于多层次的先天反应，包括局部和系统性获得性抵抗机制。植物免疫依赖于通过模式触发免疫进行的微生物/病原体相关分子模式识别，这表明每个植物细胞都依赖于源自感染部位的信号的系统性协调，因为植物缺乏人类中存在的移动免疫细胞。
模式识别受体检测病原体/微生物相关分子模式，如LPS、鞭毛蛋白、RNA、DNA或肽聚糖。包括TLRs在内的PRRs可以识别细菌成分和病原体相关分子模式，调节先天性和适应性免疫。植物细胞也能响应病原体相关分子模式，如细菌LPS、肽聚糖、鞭毛蛋白、真菌几丁质、孢子或β-葡聚糖，通过诱导宿主防御机制。值得注意的是，杂草花粉已被证明携带LPS。虽然没有文献描述花粉来源CP与微生物病原体相关分子模式在气道上皮处的共同暴露，但这种共同暴露可能通过TLR信号降低先天免疫激活的阈值。此外，暴露于某些花粉种类已被报道会破坏气道上皮细胞中的紧密连接蛋白，这表明其与已确定的变应原来源（如HDM）存在功能相似性。然而，花粉来源CP的参与尚未被确定。如果花粉来源CP能够以类似于Der p 1的方式破坏上皮屏障完整性，那么这可能促进花粉相关微生物病原体相关分子模式易位至下方的免疫细胞。然而，这种共同暴露模型仍有待实验检验。因此，进一步研究花粉的组成、其微生物群及其与环境因素的相互作用对于理解过敏性呼吸道疾病机制是必要的。
风媒花粉颗粒可以长距离传播，并且由于其吸湿特性，可作为云凝结核。它们含有水溶性糖类和糖醇，这可能进一步塑造与花粉颗粒相关的微生物组成。降水时，这些局部生态系统变得营养丰富，并为真菌孢子的萌发提供了理想的微生境，而真菌孢子是β-葡聚糖的潜在来源。
HDMs也对其微环境的变化高度敏感。它们的新陈代谢和稳态受到地理和饮食因素的影响，进而影响变应原基因的表达。当地元素，如微生物相互作用和螨虫微生物组的组成，也可能影响HDM驱动的过敏症的流行，这与花粉的环境条件性微生物群相似。螨虫的饮食含有来自人类皮肤鳞屑的角蛋白，它们的粪便颗粒释放出过敏性的消化酶。它们的粪便颗粒也含有微生物成分，包括LPS和β-葡聚糖。粪便颗粒、螨虫总提取物和纯化的螨虫变应原已被证明具有破坏支气管上皮屏障的能力，但不同暴露位点的变应原含量和暴露水平的可变性使HDM驱动的过敏性致敏变得复杂。
5.2. 疾病的诱发因素
哮喘的环境触发因素和调节因素包括烟雾、颗粒物、污染物以及细菌或病毒病原体。气候变化已被确定为导致过敏性花粉产量和变应原性增加的关键因素。例如，在高CO2浓度下生长的豚草花粉，与在环境CO2水平下生长的花粉相比，显示出花粉产量增加和更强的过敏性炎症反应。此外，与花粉相关的微生物可以被培养，并且它们的细菌产物已在人类血清学和动物气溶胶暴露模型中显示出激发过敏性疾病反应的能力。
真菌互隔交链孢霉在环境中含量丰富，尤其是在腐烂的植被中，它本身就是一个变应原来源，据报道对其主要变应原Alt a 1的致敏存在于约80%的互隔交链孢霉致敏个体中。总之，这些观察结果强调了微生物和环境相互作用在塑造变应原暴露和变应原性方面的重要性。
