中国新疆和田灰驴与新疆驴的遗传结构与选择信号

《Animals》：Genetic Structure and Selection Signals in Hetian Gray Donkeys and Xinjiang Donkeys from Xinjiang, China

　　

简单总结：中国新疆拥有两个本地驴品种：和田灰驴（HTQD）和新疆驴（XJD）。它们在体型和被毛颜色上存在显著差异，但这些差异的遗传基础此前尚不清楚。在本研究中，研究人员对这两个品种的60头驴进行了全基因组测序，并将数据与来自非洲、西亚/中亚和欧洲等其他地区的155个公开驴基因组数据相结合。研究发现，新疆驴的遗传多样性略高于和田灰驴，而欧洲和中国家驴参考群体的多样性最低。两个新疆品种在遗传上彼此非常接近，但与海外群体明显分离。尽管它们的整体遗传差异很小，但在特定基因组区域检测到了强烈的选择信号。两个基因脱颖而出：TBX3（体型的强候选基因）和ZFAT（信号较弱，可能在毛色中起作用，有待验证）。研究结果揭示了和田灰驴与新疆驴之间的密切遗传关系，并确定了表型差异背后的候选基因，为保护新疆驴遗传资源提供了遗传学基础。

摘要：和田灰驴（China_HTQD）和新疆驴（China_XJD）是中国新疆具有代表性的地方驴品种，在体型和毛色等生产表型上表现出显著差异。然而，它们的遗传背景以及受人工选择影响的分子机制尚未被系统阐明。本研究整合了60个新测序的China_HTQD和China_XJD个体的全基因组数据，以及来自NCBI数据库的155个全球参考数据集，构建了一个涵盖家养和海外群体（包括非洲、西亚和中亚、欧洲）的现代驴全基因组变异集。遗传多样性分析结果表明，China_XJD的遗传多样性略高于China_HTQD，而中国家驴参考群体（China_Ref）和欧洲群体（Europe）的遗传多样性最低。China_HTQD和China_XJD具有较大的遗传变异。主成分分析（PCA）和邻接法（NJ）系统发育分析均显示，China_HTQD和China_XJD在遗传上非常接近，聚类在中国家驴群体背景之内，并与海外参考群体表现出明显的地理遗传隔离。ADMIXTURE分析（K = 2时交叉验证误差最低）显示，这两个品种具有高度相似的遗传结构，仅在特定祖先成分的比例上存在微小差异，而它们与其他四个参考群体均明显不同。全基因组分化扫描（Fst）显示，China_HTQD和China_XJD群体之间的整体遗传分化有限，但在某些基因组区域观察到显著的分化峰。基于窗口化Fst（固定指数）和XP-CLR（跨群体复合似然比）的联合筛选，本研究鉴定出两个包含TBX3和ZFAT基因的候选基因组区域。其中，TBX3是一个强候选基因，具有稳健的选择信号和在体型调控中公认的作用。相比之下，ZFAT的信号较弱，其在毛色中的潜在作用仍属推测，需要进一步验证。总之，本研究不仅在全基因组水平上阐明了China_HTQD和China_XJD之间的密切遗传关系和群体间分化程度，还鉴定了可能与表型分化相关的候选基因，提供了TBX3的基因水平确认，并新鉴定ZFAT作为毛色变异的候选基因，从而为阐明新疆地方驴遗传资源表型差异的遗传机制提供了科学基础。

标题：中国新疆和田灰驴与新疆驴的遗传结构与选择信号——全基因组层面的解析

一、研究背景与问题

家驴（*Equus asinus*）是人类历史上最重要的家养动物之一，在长期农业生产、交通运输和边疆生计系统中发挥着不可替代的作用。随着现代畜牧业的转型，驴的价值逐渐从传统役用转向生物医学原料、特色肉乳产品及地方优质遗传资源的深度开发。早期研究揭示了驴与非洲野驴的系统发育联系，并提出多源或多阶段驯化模式；古代DNA研究进一步揭示了不同野驴类型在驯化过程中的复杂性。近年来，大规模基因组研究为区域群体的形成与分化提供了更清晰的比较框架，高质量参考基因组和重测序资源使得在全基因组水平分析家驴的遗传结构和选择信号成为可能。

新疆地处欧亚大陆腹地，历史上是丝绸之路的重要枢纽，其牲畜群体往往具有多源遗传输入。同时，干旱荒漠环境和特定的生产需求施加了持续的选择压力。在新疆地方驴品种中，和田灰驴（China_HTQD）和新疆驴（China_XJD）极具代表性。新疆驴是一个古老的土种，可追溯至公元3世纪，起源于亚洲野驴，并在南疆长期驯化形成；和田灰驴则于2006年被正式认定为独立品种，经过当地农户约200年的选育，具有优良的繁殖和泌乳性能。尽管两者地理分布邻近，但它们在体型和毛色等生产表型上差异显著。然而，这两个品种之间的遗传背景以及受人工选择影响的分子机制尚未被系统阐明，尤其是体型和毛色差异的遗传基础仍不清楚。已有研究虽然澄清了中国驴的祖先来源和遗传关系，但和田灰驴与新疆驴之间的精细遗传分化程度、在全景参考背景中的遗传定位以及表型差异相关的候选选择区域仍缺乏系统评估。由于密切相关群体通常整体分化程度低，依赖单一统计量容易产生不稳定的检测结果，因此结合严格质量控制的数据集，通过群体结构、分化指数和跨群体选择扫描进行交叉验证，是一种更为稳健的研究策略。

二、研究内容与结论

本研究对30头新疆驴（China_XJD）和30头和田灰驴（China_HTQD）进行了全基因组重测序，并整合NCBI公共数据库中全球代表性群体的基因组数据，构建了一个包含215头现代驴的全基因组变异数据集。基于严格质量控制，研究人员采用主成分分析（PCA）、邻接法（NJ）系统发育树和ADMIXTURE分析群体遗传结构与组成，结合连锁不平衡（LD）衰减和多样性指数评估遗传背景差异。以China_HTQD和China_XJD为核心比较对象，利用固定指数（Fst）和跨群体复合似然比（XP-CLR）进行群体间选择信号分析。

研究得出以下主要结论：第一，遗传多样性分析显示，新疆驴的遗传多样性略高于和田灰驴，而中国家驴参考群体和欧洲群体的多样性最低；和田灰驴和新疆驴具有较大的遗传变异。第二，PCA和NJ系统发育分析均表明，这两个新疆品种在遗传上非常接近，聚类在中国家驴群体背景之内，并与海外参考群体表现出明显的地理遗传隔离。ADMIXTURE分析（K=2时交叉验证误差最低）显示，两者遗传结构高度相似，仅在特定祖先成分比例上存在微小差异。第三，全基因组分化扫描表明，两个群体间的整体遗传分化有限（基因组平均Fst为0.005），但在特定基因组区域存在显著分化峰。通过窗口化Fst和XP-CLR的联合筛选，鉴定出两个候选基因：TBX3和ZFAT。其中，TBX3表现出强选择信号（XP-CLR峰值=56.19），并在体型调控中具有公认作用，是体型的强候选基因；ZFAT信号较弱（XP-CLR峰值=8.56），其潜在参与毛色调控仍属推测，需要进一步验证。富集分析表明，候选基因显著富集在“调控干细胞多能性的信号通路”等KEGG通路中，提示这两个品种的表型分化可能涉及多个功能通路的协同作用。

该研究发表在《Animals》期刊上。其重要意义在于：从全基因组水平阐明了和田灰驴与新疆驴之间的密切遗传关系和群体间分化模式，鉴定出与表型差异相关的候选基因，为理解这两个品种体型和毛色差异的遗传机制提供了分子证据，同时为新疆地方驴遗传资源的保护评估和后续精准育种提供了科学基础和数据支持。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）全基因组重测序：对60头驴（30头和田灰驴来自新疆皮山县某繁育场，30头新疆驴来自新疆策勒县某繁育场）进行平均约10×深度的全基因组测序，并从NCBI公共数据库获取155头全球参考驴基因组数据，涵盖中国其他地区（CL、GLD、HB、XZCM、Yangyuan）、非洲（EGY、ETH、KEN—YPO、SOM）、欧洲（CYK、English W pure Irish）以及西亚和中亚（IRA—D、KAZ、KYR、MON、YEM、TUK）等群体。（2）序列比对与变异检测：使用BWA-MEM将clean reads比对到参考基因组ASM1607732v2（GCA_016077325.2），采用GATK HaplotypeCaller进行单样本变异检测并联合基因分型，经过严格硬过滤和PLINK2过滤获得高质量SNP集。（3）群体遗传学分析：利用PLINK计算观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和多态信息含量（PIC）；使用VCFtools计算核苷酸多样性（π）和Tajima's D；基于PLINK进行纯合片段（ROH）分析；通过PCA、NJ树和ADMIXTURE分析群体结构；使用VCFtools计算窗口化Fst。（4）选择信号分析：采用窗口化Fst（窗口50 kb，步长10 kb）和XP-CLR方法（以China_XJD为参考群体，China_HTQD为目标群体）进行选择信号检测，取两种方法候选区域的交集，并与参考基因组基因注释比对以确定候选基因。（5）功能富集分析：使用DAVID进行GO富集分析，使用KOBAS 2.0进行KEGG通路富集分析，以错误发现率校正后的p值0.05为显著性阈值。

四、研究结果

（一）测序数据与参考基因组比对分析

对和田灰驴和新疆驴全基因组重测序原始数据进行质量控制后，平均获得170,631,025和180,114,408条clean reads。欧洲群体clean reads数最低，为98,392,037条。所有群体的GC含量均高于41%。各群体测序reads与参考基因组（GCA_016077325.2）的比对率为95–98%，其中China_HTQD为97%，China_XJD为98%。数据质量和比对率满足后续分析要求。

（二）遗传多样性分析结果

China_XJD群体的遗传参数略高于China_HTQD群体。六个群体的核苷酸多样性（π）中，China_Ref和Europe最低，China_HTQD和China_XJD最高（两者几乎相同）。六个群体Tajima's D中位数范围为0.803（Europe）至1.68（China_Ref），除欧洲外所有群体均超过1，提示可能存在偏离中性进化的情况，但需谨慎解释。ROH分析显示，欧洲群体的NROH和总ROH长度远高于其他五个群体，西亚和中亚及非洲群体处于中等水平，China_HTQD和China_XJD的NROH较低且相似，表明ROH积累较少。所有群体的ROH片段以短片段为主，但欧洲群体具有更高比例的长片段，而China_HTQD和China_XJD以短片为主且长度分布相似。多态信息含量（PIC）在China_HTQD和China_XJD之间相似，欧洲群体最高（0.27189）。六个群体的Ho均低于He，表明存在近交或群体亚结构。China_XJD的He和Ho略高于China_HTQD，表明新疆驴的遗传多样性高于和田灰驴。

（三）群体遗传结构分析结果

经过SNP质量控制后，215头驴的全基因组数据共获得96,892,950个SNP；经LD剪裁后，用于PCA和NJ树分析的SNP为87,991,070个。PCA结果显示，六个群体大致分为四个聚类，与地理分布对应。China_HTQD和China_XJD遗传距离最近，大多数个体重叠分布；所有中国群体聚在一个范围内；非洲和欧洲群体与其他五个群体遗传关系较远；欧洲群体完全独立聚类，遗传距离最大，结构差异最显著。PCA结果与NJ系统发育树结果一致。ADMIXTURE分析（K=2）显示，China_XJD和China_HTQD的遗传组成高度相似，但与欧洲和非洲群体差异显著。两两群体间全基因组Fst值中，中国XJD与欧洲、中国HTQD与欧洲之间的Fst最高（0.051–0.052），处于家养群体遗传分化的低水平范围；两个新疆群体之间的Fst最低（0.005），与PCA和ADMIXTURE结果一致，但在特定基因组区域检测到局部分化峰。LD衰减曲线显示，China_HTQD和China_XJD的曲线接近，且与其他群体相当。

（四）群体间选择信号分析结果

China_HTQD与China_XJD的窗口化Fst分析显示，两个群体在基因组水平的整体分化较低（低于0.1），但在某些染色体区域观察到显著峰，其中在TBX3和ZFAT附近出现明显的分化簇。XP-CLR分析在窗口化Fst相同的位置检测到对应于TBX3的显著峰，进一步确认该区域具有较高的群体分化，是强候选选择区域。对TBX3候选区域内China_HTQD与China_XJD的群体分化和遗传多样性趋势分析显示，局部Fst出现显著峰，同时China_HTQD在候选区域附近的核苷酸多样性（π）显著降低，并伴随Tajima's D负向偏移，符合近期正选择导致的选择性清除特征。窗口化Fst和XP-CLR候选基因的交集共获得35个重叠基因，其中2个（TBX3和ZFAT）被注释为体型和毛色相关基因。TBX3位点的SNP水平的等位基因频率和Fst值分析列出了该窗口内等位基因频率差异最显著的前18个SNP，XP-CLR最高值（56.19）覆盖所有列出的变异，Fst在42,681,707–42,691,755位置附近达到峰值0.1597。ZFAT区域虽然也表现出较强的选择信号（XP-CLR峰值=8.56，最大窗口Fst=0.1108），但单个SNP等位基因频率差异温和，且没有发现离群Fst值（>0.4），提示ZFAT的选择信号是由多个变异共同驱动的，而非单个高分化SNP。因此，TBX3呈现经典的“离群SNP”模式，而ZFAT则表现出多基因或软选择性清除的特征。GO富集分析显示，候选基因在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）类别中分别富集于7个、9个和9个GO条目。KEGG分析显示，候选基因显著富集于4条KEGG通路（p < 0.05），其中WNT6、WNT10A、JAK2和TBX3映射到“调控干细胞多能性的信号通路”。

五、讨论与结论

讨论部分指出，China_HTQD和China_XJD在PCA、NJ树和ADMIXTURE结果中均显示非常相似的遗传距离，表明它们具有相似的祖先组成和进化历史。欧洲群体表现出显著的遗传独特性，可能归因于历史育种实践、地理隔离、奠基者效应和潜在群体瓶颈。中国群体与非洲、欧洲和西亚海外参考群体的分离与其地理起源一致，但聚类模式可能部分受采样密度不均的影响。尽管两个新疆品种的整体Fst分化水平较弱，但在8号和12号染色体之间观察到显著的分化峰，这与先前研究中“低全基因组分化但局部适应或正选择导致局部分化峰”的观点相符。研究还讨论了约10×测序深度的合理性，指出低覆盖度数据经过适当参数优化仍可准确估计ROH，且XP-CLR依赖于等位基因频率分化，对中等深度不敏感。研究承认存在一些局限性，例如西亚和中亚部分参考群体样本量较小（KAZ=2，MON=2，IRA-D=4，YEM=3，TUK=3），欧洲样本覆盖度为6×，不同平台数据合并可能引入批次效应，且每个新疆品种的样本仅来自单一繁育场，可能无法完全代表整个分布区的遗传多样性。但参考群体仅用于背景化群体结构，主要比较在一致采样的群体中进行，结论仍具稳健性。

关于表型差异和候选基因，研究强调TBX3是一个关键的发育调控因子，直接参与肢体和组织发育。小鼠模型研究表明，TBX3缺失会导致肢体异常和发育缺陷，表明其在胚胎发育中不可或缺。TBX3通过转录抑制参与建立小鼠肢体芽中的关键表达边界，从而影响肢体发育程序。因此，TBX3可能是调控China_XJD和China_HTQD体型性状的关键候选基因。TBX3表现出稳健的选择信号（XP-CLR峰值=56.19），其作用已在肢体和组织发育中得到充分证实。相比之下，ZFAT信号较弱（XP-CLR峰值=8.56），未检测到离群SNP，其潜在作用更不确定。尽管ZFAT在其他家畜中与体型性状相关，但其在毛色调控中的可能参与主要基于其造血功能和间接调节Gata1，缺乏在马科动物中的直接证据。因此，研究人员将ZFAT作为次要候选基因，其可能对表型分化（尤其是毛色）的贡献需要通过靶向表达和功能研究进一步验证。未来研究应结合全基因组关联分析（GWAS）、等位基因效应估计、单倍型分析和功能实验来验证这些候选基因的因果作用。

结论：本研究证明，尽管和田灰驴和新疆驴这两个密切相关的本地品种具有高度相似的遗传背景，但它们保持了相当的遗传多样性。通过Fst和XP-CLR选择信号分析，研究人员在特定基因组区域发现了显著的遗传分化，并确定TBX3和ZFAT为受选择候选基因。富集分析进一步证实了它们在两个群体表型分化中的关键作用。TBX3作为主要候选基因，具有强选择信号和在体型调控中公认的作用；ZFAT信号较弱，被提议为次要候选基因，其在毛色中的潜在作用是一个推测性假设，需要在未来研究中通过直接实验验证。这些发现为理解它们表型差异的遗传机制提供了分子见解，并为保护和利用新疆地方驴遗传资源奠定了科学基础。