《Animals》：Characterization of the Complete Mitochondrial Genome of Tachypleus tridentatus and Mitochondrial Phylogenetic Analysis of Extant Limulidae
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中华鲎（Tachypleus tridentatus）是印度—西太平洋地区具有生态与保护重要性的古老海洋螯肢动物（chelicerate）。尽管已有若干线粒体基因组被报道，但涵盖鲎科（Limulidae）所有现存属的综合比较线粒体组学分析仍有限。研究人员对来自
中华鲎（Tachypleus tridentatus）是印度—西太平洋地区具有生态与保护重要性的古老海洋螯肢动物（chelicerate）。尽管已有若干线粒体基因组被报道，但涵盖鲎科（Limulidae）所有现存属的综合比较线粒体组学分析仍有限。研究人员对来自南海北部北海湾、由野生亲体繁殖的F1个体采用高通量测序获得并表征其完整线粒体基因组，并针对鲎科三个现存属开展整合比较线粒体组学分析。该环形线粒体基因组长15,006 bp，含典型37个线粒体基因，包括13个蛋白质编码基因（protein-coding genes，PCGs）、22个转运RNA基因（transfer RNA genes，tRNAs）和2个核糖体RNA基因（ribosomal RNA genes，rRNAs）。新测序中华鲎线粒体组与已发表同种线粒体组相比，基因组组织与核苷酸组成高度保守，确认了该物种既定线粒体特征。本研究主要贡献是增补一条北海湾完整线粒体组，并将其与代表所有现存鲎科物种的12条附加完整线粒体基因组、4个线粒体标记、K2P遗传距离分析以及独立的贝叶斯推断（Bayesian inference，BI）与最大似然（maximum likelihood，ML）系统发育重建相整合。这些线粒体数据间的一致性，为鲎科内遗传分化与线粒体系统发育关系提供了整合评估，并扩展了中华鲎完整线粒体基因组资源的地理代表性。
研究背景方面，鲎类（horseshoe crabs）是最古老现生海洋节肢动物，为剑尾目（Xiphosura）唯一幸存谱系，化石史可追溯至约4.5亿年前奥陶纪，形态极度保守而被称为“活化石”。现存仅4种，均属鲎科（Limulidae）：中华鲎（Tachypleus tridentatus）、巨鲎（Tachypleus gigas）、圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）及美洲鲎（Limulus polyphemus）。中华鲎为印度—西太平洋最大且分布最广鲎类，具底栖生态系统工程师作用，其鲎阿米巴细胞溶解物用于细菌内毒素检测；但海岸城市化、生境退化、填海、污染与过度利用致种群锐减，已被列为濒危种。线粒体基因组具母系遗传、结构紧凑、重组少、进化较快、细胞内高拷贝等特征，适于物种鉴定、系统发育、群体遗传与保护研究。既有文献多聚焦基因组测序注释与系统树重建，鲎科内基因组组织、核苷酸组成、密码子使用与进化动态的综合比较不足；中国沿海与台湾海峡群体遗传研究多用COI等短片段，北海湾此前无完整线粒体基因组，区域分子资源缺口明显，因此研究人员开展本研究。
主要关键技术方法方面，样本为广西水产科学研究院养殖设施中野生捕获亲体所产F1幼体，选一代表个体取体肌组织；用TIANamp Marine Animals DNA Kit提基因组DNA。测序采用DNBSEQ-T7平台做双端150 bp（PE150）测序；用GetOrganelle v1.7.7组装线粒体基因组，Pilon v1.24校正；MITOS2与tRNAscan-SE 1.21注释，以NC_012574.1为参照人工校订；BWA与Samtools评估覆盖度。用MEGA 6算核苷酸组成、AT-skew与GC-skew及RSCU；K2P模型估COX1、Cytb、12S rRNA、16S rRNA的属内/属间距离；MAFFT比对13个PCGs，DnaSP v6算Ka/Ks；用MAFFT做密码子感知比对，Gblocks去模糊区，PhyloSuite拼接，ModelFinder定模型，MrBayes做BI、IQ-TREE做ML系统发育，外类群为Ixodes hexagonus（AF081828）。
研究结果方面，3.1 中华鲎线粒体基因组结构：通过高通量测序与组装注释，得环形15,006 bp基因组，A 37.90%、T 36.13%、G 8.90%、C 17.07%，AT含量74.03%，AT-skew为0.0239、GC-skew为?0.3146；含13 PCGs、22 tRNAs、2 rRNAs；PCGs长156 bp（ATP8）至1714 bp（ND5），起始密码子含ATG、ATT、ATC、TTG，止码多为TAA，ND4L为TAG，COX3、ND5、Cytb具不完全终止密码子，转录后多聚腺苷化补全。RSCU显示亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）等A/U结尾密码子偏好。Ka/Ks均小于1，COX1最低0.0303，ATP8最高0.4301，表明所有PCGs受净化选择且约束强度异质。tRNAs长62–71 bp，具典型三叶草结构；16S rRNA为1326 bp、12S rRNA为779 bp；控制区约391 bp。
3.2 鲎科现存属线粒体遗传分化：基于COX1、Cytb、12S rRNA、16S rRNA的K2P距离显示，属间距离始终高于属内；COX1属内均值Tachypleus 0.059、Carcinoscorpius 0.025、Limulus 0.025，Tachypleus–Carcinoscorpius为0.113，Limulus与两亚洲属达0.182/0.186。Cytb分化更高，属间0.156–0.319，属内0.037–0.088；rRNA分化较低但格局一致。结论为三属线粒体分化明确，Tachypleus与Carcinoscorpius亲缘近于二者与Limulus。
3.3 鲎科现存属线粒体系统发育关系：BI与ML基于13个PCGs串联数据集得出高度一致拓扑，恢复Carcinoscorpius、Tachypleus、Limulus三单系；C. rotundicauda聚为一支，L. polyphemus独立强支持支，Tachypleus内含T. gigas与T. tridentatus，新基因组PZ744148与已发表T. tridentatus（如MW420922）聚在一起。两法均支持亚洲两属更近、美洲属更深，与K2P结果吻合。
讨论部分总结方面，研究人员指出新北海湾线粒体组在长度、37基因集、强AT偏向（74.03%）、A/U结尾密码子偏好与低Ka/Ks等方面与既往同种一致，主要确认中华鲎线粒体结构进化保守性，而非新特征发现；底栖潮间带氧供与盐温波动背景下，呼吸链PCGs保守或与功能约束有关，但不能单凭序列保守证适应该环境。四标记一致显示Tachypleus+Carcinoscorpius为印度—西太平洋谱系、Limulus为大西洋谱系，但线粒体为母系非重组单系，不能与核基因组历史等同，不能据K2P距离直接判定生殖隔离或物种边界。单一个F1个体仅代表母系单倍型，不宜作种群基线；北海湾群体未被证明为独特线粒体谱系，该基因组应视为区域参考资源。保护上应保护代表群体与产卵育幼生境，避免无评估移植，管理单元（MUs）或进化显著单元（ESUs）须结合核标记/全基因组SNP。
结论部分翻译：本研究提供了源自北海湾野生亲体F1中华鲎个体的完整线粒体基因组，扩展了该物种可用线粒体组学资源的地理代表性。与已发表中华鲎线粒体组比较表明，北海湾来源线粒体组的主要结构与组成特征高度保守，确认而非大幅修订该物种既有线粒体特征。本研究主要贡献是将新区线粒体组与涵盖鲎科所有现存属的比较完整线粒体基因组及四个线粒体标记整合；K2P遗传距离格局与BI和ML系统发育的一致，为三个现存鲎科属间线粒体遗传分化提供一致证据，并支持Tachypleus与Carcinoscorpius的线粒体关系近于二者各自与Limulus的关系。因这些推断仅基于母系遗传线粒体基因组，不应被解释为物种树关系或全基因组谱系分化的确定证据；本线粒体数据集本身也不能解析中华鲎内种群结构、当代基因流或种群历史。因此须整合独立遗传的核标记与全基因组SNP以评估线粒体—核一致并解析上述种群级进化过程。新获线粒体组主要应被视为中华鲎物种鉴定、比较线粒体组学及未来种群与保护遗传研究的区域线粒体参考资源，而非足以解析种群连通性、种群历史或全基因组进化关系的证据。论文发表于《Animals》。
