手动双离心制备方案对马血小板富血浆细胞与生长因子组成的影响

《Animals》：Influence of Manual Double-Spin Preparation Protocols on the Cellular and Growth Factor Composition of Equine Platelet-Rich Plasma

　　

本研究为前瞻性、随机、离体(ex vivo)研究，旨在探讨手动双离心离心方案对马血小板富血浆(PRP)细胞与生长因子组成的影响。研究人员采集20匹健康马的血液并分两阶段开展实验：阶段A（n=10）比较9种首次离心方案，依据血小板(PLT)富集与白细胞(WBC)减少筛选出两种方案；阶段B（n=10）将筛选方案与9种二次离心条件组合，生成18种PRP制剂。研究人员测定PLT、WBC、红细胞(RBC)浓度以及血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)与转化生长因子-β1(TGF-β1)浓度。结果显示：首次离心各方案间细胞组成无显著差异（p>0.05）；阶段B所有终产品均实现血小板富集与白细胞耗减，RBC污染可忽略；二次离心力显著影响PDGF-BB与TGF-β1浓度（p<0.001），PDGF-BB由200×g下的2629 pg/mL（95% CI：2111–3274）升至1000×g下的3467 pg/mL（95% CI：2784–4317），TGF-β1由13364 pg/mL（95% CI：11286–15824）升至16998 pg/mL（95% CI：14355–20127）；TGF-β1还随二次离心时长增加而上调（p=0.01）。PLT浓度与PDGF-BB（ρ=0.604）及TGF-β1（ρ=0.691；均p<0.001）呈正相关，WBC浓度与两种生长因子无显著关联。研究表明：马PRP组成受制备方法与供体相关变异共同影响，仅依靠方案标准化难以保证生物学一致的PRP产品。

研究背景方面，血小板富血浆（PRP，platelet-rich plasma）是由全血去除红细胞并部分或完全去除白细胞后、在缩减的血浆体积中获得高浓度血小板（PLT）的生物治疗产品，其α颗粒储存生长因子（GFs）、细胞因子与结构蛋白，用于肌腱、韧带、关节等组织修复。目前文献中“PRP”涵盖生物学差异很大的产品，制备方式包括手动、半自动与全自动，离心力、时长、血浆采集方式及是否纳入buffy coat（白细胞层）均会改变终产品。分类系统虽多但无统一定义，系统综述显示仅少数研究充分报告制备方案与细胞组成，导致临床结果难以比较。因此，在受控条件下系统评估手动双离心方案、并表征终产品组成，是亟待补齐的知识空白。研究人员假设：提高离心力与延长离心时间会带来更高血小板富集，从而升高PDGF-BB与TGF-β₁浓度。

本文发表于《Animals》。研究人员通过开展前瞻性、随机、离体实验室研究，证明马PRP组成既受离心方案影响，也受供体马个体生物学变异影响，说明仅优化离心协议不足以保证产品一致，对马再生医学中生物制剂标准化具有重要警示意义。

主要关键技术方法如下：研究人员采用两阶段设计，阶段A自10匹健康马取血并分入9种首次离心方案（100/300/700 G，5/10/18 min），依PLT与WBC组成筛选方案C（100 G、18 min）与方案D（300 G、5 min）；阶段B自另10匹健康马取血，经方案C/D首次离心后，再进行9种二次离心（200/700/1000×g，5/10/20 min），形成18种PRP制剂。细胞计数由血液分析仪完成，生长因子采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测PDGF-BB与TGF-β₁；统计使用Friedman检验、广义线性混合效应模型（GLMM）、Spearman相关与混合效应广义加性模型（GAM）。样本队列为20匹2–12岁、临床健康、基线血常规无异常的马，分两批各10匹。

研究结果部分，3.1 Phase A：研究人员比较9种首次离心方案，发现PLT、WBC、RBC浓度存在明显马间变异，但方案间无统计学差异（p>0.05）；按“先降WBC、再提PLT”的层级排序，选出方案C与D进入阶段B。3.2 Phase B：所有18种制剂相对基线全血均显著血小板富集（p<0.001）、白细胞耗减（p<0.001）、RBC污染可忽略；二次离心力对PDGF-BB与TGF-β₁影响显著（p<0.001），1000×g下PDGF-BB高于700×g（p=0.022），TGF-β₁在700与1000×g间无差异（p=0.956）；二次离心时长仅显著抬高TGF-β₁（20 min高于5/10 min）。PLT与PDGF-BB、TGF-β₁强正相关，WBC无显著相关；混合模型显示条件R²远高于边际R²，说明马个体随机效应解释大量变异。PDGF-BB对PLT近似线性，TGF-β₁对PLT呈非线性（ΔAIC=9.17）。

讨论部分总结：研究人员指出，更高离心力/更长时间并未带来生长因子的剂量式增长，可能与血小板结构损伤、提前活化或回收平台期有关；血小板浓度是PDGF-BB与TGF-β₁的最强预测因子，白细胞作用尚不明且可能随临床场景而异。供体相关变异来自血小板计数、活化能力、α颗粒含量、遗传与生理因素等，是自体PRP疗法固有异质性来源。阶段A无显著差异受样本量小与马间变异干扰；研究局限包括仅测两种生长因子、冻存时长不一、未算总回收率与产量、采血镇静潜在影响等。研究人员强调应同时表征终产品与供体，而非仅凭制备方法假定生物学等价。

结论部分翻译：本研究表明，马PRP的组成受制备方案与供体马显著个体差异共同影响。尽管评估了多种手动双离心条件，方案相关效应仅解释终产品部分变异。正如预期，血小板浓度与PDGF-BB和TGF-β₁浓度强相关，而个体马间差异也对细胞与生长因子组成贡献显著。这些发现说明，仅靠离心方案优化与标准化不太可能保证一致的马PRP产品；因此应将更多注意力放在终产品表征上，而非依据所用制备方法假定生物学等同。有必要进一步识别造成显著个体间变异的供体相关因素，并判断这些差异是否影响PRP的生物学活性及最终临床疗效。