基于电化学发光（ECL）的免疫测定法验证用于测定抗大肠杆菌O-脂多糖抗原的抗体水平

《Microbiology Spectrum》：Validation of electrochemiluminescent (ECL)-based immunoassay to determine the levels of antibodies against Escherichia coli O-lipopolysaccharide antigens

　　

肠外致病性大肠杆菌（extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC）是侵袭性感染的重要病因，包括尿路感染、新生儿脑膜炎和菌血症。多重耐药ExPEC菌株的出现加剧了对有效预防性干预措施的需求。强生公司开发了ExPEC10V，这是一种针对与致病性ExPEC菌株相关的十种不同O-抗原的多价疫苗。为评估ExPEC10V引发的体液免疫应答，研究人员最初采用了靶向大肠杆菌O-多糖（O-polysaccharide, O-LPS）抗原的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法。然而，鉴于该疫苗的多价抗原组成，并为了提高通量和效率，研究人员开发、鉴定并验证了一种多重电化学发光（electrochemiluminescent, ECL）免疫测定法，能够同时测定人血清中针对全部10种O-抗原及载体蛋白（EPA）的IgG抗体滴度。研究人员利用一项正在进行的临床试验中的血清样本，对该ECL测定的相对准确度、精密度和线性进行了验证。对真实样本的精密度在多次运行中进行了系统评估，以确保基线抗体水平的可靠检测。通过使用同源和异源O-LPS抗原进行竞争抑制，验证了其特异性。通过评估宽浓度范围内的总误差、线性和稀释线性，进一步确认了测定性能。通过改变关键孵育时间测试了稳健性，同时使用两台不同的ECL读板仪证明了耐用性。样本稳定性在多次冻融循环和4–8°C长时间储存条件下得到验证。该测定在所有测试抗原中均表现出可接受的精密度、相对准确度、线性和稳健性。尽管大多数抗原满足耐用性和特异性标准，但O6A在同时异源竞争时未通过；然而，当使用单个异源抗原测试时，达到了可接受的特异性。为进一步研究O6A的结果，研究人员评估了不同抗原包被浓度；在较高或较低浓度下均未观察到性能改善。样本处理和储存条件与参考条件相当，预包被板可稳定保存长达3年。基于ECL的免疫测定法用于测定人血清中抗大肠杆菌O-抗原和EPA蛋白的IgG抗体滴度的验证已成功完成，所有参数均满足预设接受标准。该测定为评估疫苗诱导的免疫应答提供了一个稳健、敏感且高效的平台，支持临床开发和未来的研究应用。

肠外致病性大肠杆菌（extraintestinal pathogenic Escherichia coli, ExPEC）是导致尿路感染、新生儿脑膜炎和菌血症等侵袭性感染的重要病原体。随着多重耐药菌株的增多，侵袭性大肠杆菌病（invasive E. coli disease, IED）的发病率和经济负担不断上升，其病死率可达12%–18%。美国和欧洲的监测数据显示，O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75等10种O血清型约占据大肠杆菌血流感染的65%。为预防这些感染，强生公司开发了多价疫苗ExPEC10V，其靶向上述10种O抗原，并以去毒化铜绿假单胞菌外毒素A（exotoxin A, EPA）作为载体蛋白。在初期临床试验中，该疫苗在≥60岁成人中显示出安全性和免疫原性。为评价疫苗诱导的体液免疫应答，早期采用针对大肠杆菌O-脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）抗原的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法，但该方法每次只能检测一种抗原，难以满足含10种成分的多价疫苗的高通量评价需求。因此，研究人员开发并验证了一种多重电化学发光（electrochemiluminescent, ECL）免疫测定法，用于同时测定人血清中针对全部10种O抗原及EPA的IgG抗体滴度。本验证研究旨在按照监管指南和行业白皮书，系统评估该ECL测定法的分析性能，包括线性、精密度、相对准确度、稀释线性、特异性、稳健性、样本稳定性等。验证样本来自NCT03819049临床试验。研究结果显示所有参数均达到预设接受标准，成功完成了方法验证。该ECL平台为疫苗诱导免疫反应的评价提供了稳健、敏感且高效的检测工具，支持了ExPEC疫苗的临床研发和大规模临床试验。论文发表于《Microbiology Spectrum》。

研究人员使用了多重电化学发光（ECL）免疫测定平台，将10种O抗原与EPA共11种不同抗原子分别包被在多斑点微孔板的高结合碳电极上，以SULFO-TAG标记的抗人IgG二抗进行检测，通电后激发光信号，光强与样本中抗原特异性抗体水平成正比。验证样本来自NCT03819049临床试验受试者血清。主要方法包括：利用三个高滴度血清池的系列稀释样本评估线性、精密度和相对准确度；采用竞争抑制实验（同源和异源）验证特异性；通过响应面设计改变血清和检测抗体孵育时间评价稳健性；使用两台不同ECL读板仪考察耐用性；并评估了冻融循环、4–8°C和–80°C储存条件下样本的短期和长期稳定性，以及预包被板在4°C下长达3年的稳定性。

精密度、线性和相对准确度：通过三个浓度水平（高、中、低）的血清池各制备10个浓度水平的线性样本，对全部抗原进行了检测。结果显示，除O6A外，其余抗原均可在由精密度（%CV_IP≤30%）和总误差（%TE≤50%）界定的线性范围内确定定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）和定量上限（upper limit of quantification, ULOQ）。O6A由于在测定范围内精密度不达标，其范围改为基于线性（斜率90%置信区间在0.80–1.25）和相对准确度（%TE≤50%）设定。整体精密度评估中，所有抗原（包括O6A）的重复性%CV和中间精密度%CV均低于30%，O6A的%CV_IP为28.60%。

线性评估：所有抗原在测定范围内的log₁₀–log₁₀标绘图斜率90%置信区间均落在0.80–1.25之间，线性合格。

分析测量范围：针对所有血清型建立了LLOQ和ULOQ，具体范围因抗原而异，例如EPA的LLOQ和ULOQ分别为5,704和6,981,511 AU/mL。

稀释线性评估：在1,000×、5,000×和25,000×三个稀释因子下评估稀释线性。对于部分抗原，1,000×稀释低于可测量范围而被认为不可评价，但所有抗原均明确了可接受的稀释因子以用于高滴度样本复测。

质量控制样本表现：高、低质控样本（high and low quality control, HQC和LQC）的中间精密度%CV均≤30%，满足预设标准，表明未来运行的有效性。

特异性评估：通过同源和异源竞争抑制实验评估特异性。同源竞争下，所有抗原均达到至少50%的样本抑制倍数≥7；异源竞争（混合）下，O6A仅25%样本满足≤3的标准，但在单独异源竞争时O6A达标。进一步评估不同包被浓度未能改善O6A的表现，但整体上该测定仍具有抗原特异性。

稳健性评估：采用响应面设计改变血清样本和检测抗体的孵育时间（90–150分钟），结果显示质控失败率最大为6%，低于预设10%阈值，表明测定在程序性偏差下依然稳健。

血清样本和板稳定性：样本在多次冻融循环及4–8°C储存条件下与参考条件的平均log₁₀差异接近零，Dunnett校正90%置信区间位于等效界值内；长期稳定性在17个月内保持；预包被板在4°C储存3年后仍保持稳定，系统差异符合接受标准。

讨论部分指出，验证结果证实该ECL免疫测定法在精密度、相对准确度、线性和稳健性方面均满足关键分析性能要求，O6A的局限性不影响整体适用性。O6A在混合异源竞争中的交叉反应可能源于高结合板上抗原的疏水相互作用导致表面密度和取向变化，暴露保守核心表位，但通过单独异源竞争可达到特异性标准。该测定已被监管机构接受，并用于ExPEC疫苗计划的临床评价，包括III期Embrace研究。研究结论翻译为：该ECL免疫测定法能可靠地测定人血清中针对多种大肠杆菌O抗原和EPA的抗体滴度，支持其用于临床评价的可靠性。