《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Expanded evaluation of a robust on-line sample cleanup-LC-MS platform suited for new approach methodologies (NAM)
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生物分析中的样品制备可能需要大量（手动）步骤和耗材。这类程序在成本、通量和绿色性方面可能成为瓶颈。对于新方法学（NAM）如类器官和器官芯片系统的分析也是如此。在此背景下，专门用于测量NAM相关细胞培养基（CCM）中药物的方法正在开发中。对于基于质谱的分析，采用
生物分析中的样品制备可能需要大量（手动）步骤和耗材。这类程序在成本、通量和绿色性方面可能成为瓶颈。对于新方法学（NAM）如类器官和器官芯片系统的分析也是如此。在此背景下，专门用于测量NAM相关细胞培养基（CCM）中药物的方法正在开发中。对于基于质谱的分析，采用了自动化过滤/过滤器反冲固相萃取-液相色谱（AFFL-SPE-LC）。案例研究表明，“AFFL”平台可大幅减少样品制备工作量，因为其“自清洁”过滤特性和SPE条件可去除生物来源样品中可能造成堵塞/污染的物质，例如CCM中的盐和蛋白质含量。本文提供了AFFL平台用于CCM分析的更广泛性能展示，采用了一个扩展的疏水性小分子药物组。所研究的AFFL平台表现出可重现的色谱性能，以及满足用途的跨基质和跨柱稳健性。可进行数百次进样且具有满意的重复性（例如，保留时间RSD<1%），对所研究的各种CCM基质干扰有限。还展示了实际的NAM应用。该方法在绿色性方面具有明显优势，AGREEprep得分为0.71，而更传统/商业化的方法得分<0.55。研究人员的该方法的一次性塑料耗材用量为28克/100个样品，相比先前建立的基准（500克/100个样品）改善了近20倍。综上所述，这些结果表明AFFL为NAM来源样品的化学分析提供了一种稳健、低废物且可扩展的基于LC-MS的工作流程。
研究背景：新方法学（NAM）包括类器官、器官芯片系统等，被视为动物实验的潜在替代方案。然而，此类复杂生物样本的化学分析面临样品制备步骤繁琐、自动化程度低和重现性不足等挑战。细胞培养基（CCM）作为药物递送载体和代谢物储库，富含盐、蛋白质等基质成分，常规离线处理方法成本高、通量低，且传统在线固相萃取-液相色谱（SPE-LC）易发生堵塞。因此，需要开发稳健、自动化、低耗材的样品净化平台。研究人员对自动化过滤/过滤器反冲固相萃取-液相色谱（AFFL-SPE-LC）平台进行了扩展评估，旨在验证其用于CCM中药物分析的综合性能。相关论文发表在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。
技术方法：研究采用AFFL-SPE-LC-MS平台，包括MaXis II ETD飞行时间质谱和TSQ Vantage三重四极杆质谱（用于残留研究）。使用Purospher STAR RP-18分析柱和SPE捕集柱，进样量5 μL，梯度洗脱。四种不同组成的CCM（取自挪威奥斯陆大学Hybrid Technology Hub）中添加90种疏水性小分子药物（LogP范围约-4至6）。采用AGREEprep评分评估绿色性。
研究结果：
一般色谱性能：通过陡峭梯度在10分钟内实现90种药物筛查，其中24种未检出（多为LogP<1的极性化合物），疏水性药物信号良好；120次重复进样保留时间RSD<1%，表明重现性高。
不同细胞培养基间的相似性能：在四种CCM基质中，所选20种药物的保留时间和峰面积RSD大多<5%，平均信号强度为水溶液的80%-120%（异丙托溴铵和阿托品除外），但可卡因在CCM中一周内明显降解，总体显示跨基质稳健性。
二维图谱显示质谱干扰少：在四种CCM中未观察到蛋白多电荷峰带，也未发现聚合物流出物（质量差44 Da）的干扰，ESI源维护需求低。
样品制备的稳健性—捕集柱间重现性：平台可连续进样>1000次无需更换SPE捕集柱；新捕集柱经5次 conditioning 后，四根捕集柱间保留时间RSD为0.1%-0.2%。
残留：采用高灵敏三重四极杆质谱监测，代表药物的峰面积残留为0.3%-0.4%，满足药物代谢研究需求。
相比传统方法显著更高的绿色性：AGREEprep得分为0.71，而传统/商业化方法（蛋白沉淀、液液萃取、电膜萃取）得分仅为0.36-0.55。塑料耗材用量为28 g/100样品，相比蛋白沉淀基准（511 g/100样品）降低约20倍。
实际应用：在氟西汀与人类胃泌素类器官的研究中，发现培养板外围孔的药物浓度升高，归因于开放孔中的蒸发，从而可采取缓解措施，证明该平台可用于排查NAM实验中的变异来源。
线性与精密度：咪达唑仑、普萘洛尔和他莫昔芬在1-200 ng/mL范围内线性相关系数r<sup>2</sup>>0.99，三者的RSD分别为0.6%-5%、1%-4%和3%-10%。
讨论：研究指出该平台对亲水性药物保留不足，可考虑采用亲水相互作用液相色谱（HILIC）等替代策略；对于含大量有机溶剂或血清的培养基可能受限。AGREEprep评分存在约10%的评估者间差异。结论部分翻译：对AFFL-SPE-LC平台用于细胞培养基中小分子药物分析的扩展评估已开展。研究人员发现该系统在扩展的分析物组上表现出稳健的色谱性能，并对多种CCM基质具有稳健性。值得注意的是，与传统/商业化方法相比，该系统在步骤数量/自动化和绿色性方面具有实质性优势。该系统将继续针对色谱性能、速度和缩小规模进行微调；初步数据表明，0.3 mm内径分离柱也可能适用于该仪器装置和样品类型，这将进一步减少溶剂和样品消耗，并可能通过减少径向稀释而提高灵敏度。后者的优势可在，例如，单类器官分析中提供显著优势。总之，这些结果支持在基于NAM的研究中向复杂生物样品的全自动在线分析工作流程转变。
