驱动实验室进化鼠伤寒沙门菌环丙沙星耐药性的基因突变

《Microbiology Spectrum》：Genetic mutations driving ciprofloxacin resistance in laboratory-evolved Salmonella Typhimurium

　　

环丙沙星耐药性在鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）中是一个重要的公共卫生问题，而耐药性演变的机制尚未被充分阐明。在此，研究人员通过在抗生素选择下连续传代，分离出环丙沙星耐药性沙门菌突变株，并对其进行全基因组测序，以揭示与耐药性相关的主要突变。Low CipR突变株在ramR、icdA、lipB和gyrA中获得了四个染色体突变，而High CipR突变株还获得了gyrB、yaiC和corA中的其他突变。功能表征确定，ramR中的突变导致外排泵上调，而icdA和lipB突变引起的TCA循环中断导致代谢改变。这些变化通过增加全局调节因子MarA的表达并降低OmpF依赖性膜通透性，间接增强了耐药性。尽管观察到GyrA中的G105A替换，酶学分析证实其不能支持对环丙沙星的耐药性，可能是因为结构改变极小。GyrB488–489dup与环丙沙星存在下保持超螺旋以及增强的氟喹诺酮耐药性相关，提示其在耐药性演变中发挥主要作用。其他突变中，yaiC突变损害生物膜，corA突变影响细胞内镁的积累，可能在抗生素压力下稳定细菌细胞包膜。这些发现为沙门菌环丙沙星耐药性的多因素机制提供了新的解释，并提出了对抗抗菌素耐药性的靶标。

鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）是重要的人畜共患食源性病原体，其感染在免疫低下患者中需抗生素治疗。环丙沙星作为一线药物，其耐药菌株的全球蔓延已严重威胁临床治疗。然而，耐药性演变过程中不同基因突变如何协同作用仍不清楚。为揭示这一机制，研究人员以野生型14028s为起始菌株，在递增环丙沙星浓度下连续传代，获得低水平（Low CipR）和高水平（High CipR）耐药突变株。通过全基因组测序、基因敲除、qRT-PCR、蛋白质印迹、酶学分析等技术，系统阐明了突变的功能影响。该研究发表于《Microbiology Spectrum》。

主要技术方法包括：对Low CipR和High CipR进行全基因组测序并与野生型比较；利用实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测相关基因表达；使用蛋白质印迹验证脂酰化修饰缺失；构建ramR、icdA、lipB、yaiC、corA等基因敲除株并测定最小抑菌浓度（MIC）；通过质粒超螺旋实验和酶学抑制实验评估DNA旋转酶功能；利用刚果红平板检测生物膜形成；采用核糖开关报告系统测定c-di-GMP和Mg²⁺水平；并在J774A.1巨噬细胞中检测侵袭与复制能力。

结果部分：

1. 产生耐药性的沙门菌突变株：MIC测定显示Low CipR和High CipR的MIC分别为1 μg/mL和2 μg/mL，较野生型（0.031 μg/mL）提高32倍和64倍，均达到CLSI耐药标准。

2. 低耐药和高耐药突变株中导致环丙沙星耐药的突变鉴定：全基因组测序发现，Low CipR携带ramR、icdA、lipB、gyrA四个突变，High CipR额外获得gyrB、yaiC、corA突变。

3. 耐药沙门菌中ramR突变导致外排泵组成性表达：ramR基因的RamRΔ28–31缺失破坏了DNA结合域，解除对ramA的抑制，使acrAB外排泵组分持续高表达，qRT-PCR证实CipR突变株中ramA、acrA、acrB mRNA水平不依赖环丙沙星而显著升高。

4. lipB和icdA突变破坏TCA循环，通过外排泵激活增强耐药：lipBV102fs和icdAI299fs产生截短蛋白，导致TCA循环停滞，Western blot证实脂酰化E2亚基缺失。TCA循环障碍引起代谢应激，qRT-PCR显示marA表达升高、ompF表达降低，从而增加外排并减少药物摄入。

5. DNA旋转酶突变降低超螺旋效率但增加耐药性：gyrA G105A替换对耐药贡献较小，酶学实验显示其IC50接近野生型；而gyrB488–489dup位于TOPRIM结构域，显著降低超螺旋效率，并在环丙沙星存在下维持DNA功能，对莫西沙星的IC50明显升高，是高耐药性产生的关键因素。

6. yaiC和corA突变在高耐药突变株中的潜在作用：yaiC突变导致c-di-GMP合成障碍和生物膜形成受损；corA突变产生截短的CorAE84fs，破坏Mg²⁺通道，同时mgtA、mgtB表达代偿性升高，可能通过维持高Mg²⁺稳定膜结构。

7. CipR突变株在巨噬细胞中侵袭和复制降低，但不受环丙沙星影响：巨噬细胞保护实验显示，CipR突变株基础侵袭和复制能力低于野生型，但环丙沙星处理不进一步抑制其存活，而野生型则显著下降。

8. Low CipR呈现潜在多药耐药，而High CipR表现出交叉敏感：MIC谱显示Low CipR对四环素和甲氧苄啶的耐药倍数升高明显，High CipR则对氯霉素、四环素等敏感性部分恢复，甚至对硝基呋喃妥因更敏感。

9. CipR突变株中的功能缺失基因对环丙沙星耐药的不同贡献：基因敲除实验表明，ΔramR使MIC提高4倍，ΔicdAΔlipB双敲除也提高4倍，而ΔyaiC和ΔcorA不影响MIC，提示二者不直接增加耐药，而可能缓解高耐药带来的生理成本。

讨论部分总结：该研究揭示了沙门菌环丙沙星耐药并非由单一突变所致，而是外排泵上调、TCA循环中断、DNA旋转酶改变等多种突变协同作用的结果。gyrA G105A虽贡献有限，但gyrB重复突变是水平耐药升高的主要因素。yaiC和corA突变可能通过降低能量消耗和维持Mg²⁺稳态来补偿耐药适应性代价。与临床常见的gyrA Ser83/Asp87突变不同，本研究中发现的突变组合体现了实验室连续选择下的独特适应路径，为理解耐药演变机制和开发新型抗耐药策略提供了重要靶点。