Nur77-CypA相互作用的结构基础及环孢素A介导的竞争性置换

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Structural Basis of Nur77-CypA Interaction and Cyclosporine A-Mediated Competitive Displacement

　　

摘要：

核受体Nur77与环孢素蛋白A（CypA）和环孢素A（CsA）已被证实参与炎症、细胞凋亡和代谢调节相关的信号级联之间的相互作用。然而，调控它们之间相互作用的根本分子机制尚不清楚。我们利用核磁共振波谱学结合AI驱动的分子对接，解析了Nur77配体结合域（LBD）与CypA的界面。NMR分析描绘了结合模式，揭示了一种微弱但特异的蛋白质-蛋白质相互作用。将实验结果与AI建模相结合，产生了一个高置信度的复合物结构模型，并通过突变分析验证，并扩展至NR4A家族旁系同源蛋白的研究。引人注目的是，CsA并不直接与Nur77 LBD结合。相反，CsA占据CypA，并通过竞争实验证明，它从同一结合沟中竞争性置换Nur77。我们的发现阐明了Nur77-CypA相互作用的机制，并精炼了CsA的作用模式，对治疗开发具有重要意义。

引言

Nur77（NR4A1）是NR4A家族中的一种孤儿核受体，被归类为即早基因，可被多种刺激迅速诱导表达[1]、[2]。它在细胞增殖、凋亡、代谢和免疫调节等多种生物学过程中发挥关键的调控功能[3]。尽管Nur77的配体结合域（LBD）缺乏内源性配体的经典口袋，但越来越多的外源化合物被鉴定可与该结构域结合，使其成为药物发现的新兴且具吸引力的靶点[4]、[5]、[6]。其中，环孢素A（CsA）被报道可扰动Nur77参与的多种信号通路，发挥依赖于细胞环境的调节作用[7]：在T细胞杂交瘤中，CsA抑制钙信号，下调Nur77蛋白、其DNA结合活性及启动子活性，从而阻断活化诱导的凋亡[8]；在炎症环境中，CsA通过抑制p38α减少Nur77磷酸化，增强NF-κB的抑制作用[9]。然而，CsA是否直接与Nur77 LBD结合仍不清楚，特别是考虑到CsA主要被认为是CypA的强效抑制剂，CypA是一种普遍表达的肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIase），同时也是分子伴侣[10]。通常，CypA参与蛋白质折叠、转运和信号转导[11]。CypA的PPIase活性被CsA特异性抑制，CsA形成CsA-CypA复合物以发挥免疫抑制作用，主要通过阻断其酶活性实现[12]、[13]、[14]。越来越多的证据表明，Nur77、CypA和CsA在多种细胞信号通路中存在功能性的相互作用[7]、[8]、[15]。在各种病理环境中，CypA的功能与Nur77调控的通路相关联，包括NF-κB驱动的炎症、肿瘤细胞凋亡以及神经退行性变和动脉粥样硬化中的免疫失调[16]、[17]。

尽管这三种分子常被涉及于细胞信号传导中，但它们的精确相互作用方式以及调控其相互作用的机制仍界定不清。以往文献报道了Nur77与CypA在不同细胞环境中差异性表达和功能相互作用，但这些研究依赖于细胞裂解液的共免疫沉淀、基因敲低或药理学抑制，这些方法并不能明确确立直接的物理相互作用[15]。CypA是否直接与Nur77相互作用也尚未得到实验验证。解决这些问题对于破译Nur77信号逻辑和指导结构导向药物设计至关重要，构成了本研究的核心驱动力。

在此，我们结合NMR波谱学、AI辅助结构预测和竞争实验，解析了Nur77 LBD、CypA和CsA之间的分子相互作用。通过整合AI预测模型与NMR衍生的结合约束和定点突变分析，我们确定了Nur77 LBD-CypA复合物的结构模型，揭示Nur77通过H1和H3螺旋之间的内在无序区域与CypA的底物结合裂口相互作用。这种相互作用模式在NR4A核受体家族中是保守的，尽管不同的旁系同源蛋白具有不同的结合亲和力。值得注意的是，CsA并不直接与Nur77 LBD结合。相反，CsA通过占据同一位点竞争性置换Nur77从CypA的结合。总体而言，这些发现弥补了Nur77调控结构理解中的关键空白，并确立Nur77-CypA界面为一个构象可塑性调控中枢。靶向这一先前未被表征的蛋白质-蛋白质相互作用可能为调节Nur77在炎症和肿瘤发生中的作用提供新的治疗途径。

各章节摘要

蛋白质制备

编码NR4A核受体配体结合域（LBD）和CypA的重组质粒，各带有His₆标签，被转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。转化后的细胞在LB培养基中于37°C培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8。随后通过加入0.5 mM异丙基 β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，并在20°C下继续培养20小时。对于¹⁵N标记蛋白样品的制备，大肠杆菌细胞

CsA不与Nur77 LBD直接相互作用

CsA是由十一个氨基酸残基组成的环状十一肽，最初从真菌Tolypocladium inflatum中分离得到[18]。CypA是一种普遍表达的胞内蛋白，是CsA的主要受体。它采取八链反平行β桶折叠，中央桶芯的两端由α螺旋和环区封闭[13]。CypA负责其肽基脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性的活性位点与

讨论

Nur77、CypA和CsA之间的分子相互作用长期以来被认为与多种病理生理过程相关。在此，我们解析了Nur77 LBD-CypA界面，并重新定义了CsA在这一三方体系中的药理作用。我们的发现补充了CsA与Nur77直接相互作用的传统假设，转而确立了一种竞争性置换机制，即CsA结合CypA并阻断Nur77进入底物结合沟（图5D）。

Nur77的一个特征是

资助/致谢

本工作得到中国科学院战略性先导科技专项（编号：XDB0540000）、国家自然科学基金（编号：22277123和22374156）以及中国科学院青年科学家基础研究项目（编号：YSBR-068）的资助。

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刘一湘：起草原稿、监督、资源、方法学、获取经费、数据管理、概念构思。江玲：审阅与编辑、监督、资源、获取经费、数据管理。李聪刚：可视化、监督、资源、获取经费。朱文凯：可视化、资源。陈佳文：可视化、数据管理。陈朗：起草原稿、方法学、调查、数据管理

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作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

原创性与AI工具使用说明声明

我，以下签署人，特此声明题为"《Nur77-CypA相互作用的结构基础与环孢素A介导的竞争性置换》"的本文是我们自己的原创性工作。我们独立开展了研究、论证并撰写了初稿和实质性草稿。

在准备本文最终版本时，我们使用了DeepSeek（一种AI辅助语言工具），仅用于语法检查、文风润色和语句流畅性

利益冲突声明

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陈朗|陈佳文|朱文凯|李聪刚|江玲|刘一湘

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