《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Comprehensive microRNA profiling coupled with function-based feature selection reveals a biomarker panel for predicting CAR-T cell exhaustion
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摘要嵌合抗原受体（CAR）T细胞耗竭限制了持久的治疗效果，尤其是在持续抗原刺激的情况下。尽管转录组学和表观基因组学分析促进了我们对CAR-T细胞耗竭的理解，但微小RNA（miRNA）的贡献仍缺乏充分表征。在此，我们利用体外重复抗原刺激模型生成的耗竭CAR-T细胞，首次呈现了m
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞耗竭限制了持久的治疗效果，尤其是在持续抗原刺激的情况下。尽管转录组学和表观基因组学分析促进了我们对CAR-T细胞耗竭的理解，但微小RNA（miRNA）的贡献仍缺乏充分表征。在此，我们利用体外重复抗原刺激模型生成的耗竭CAR-T细胞，首次呈现了miRNA表达的全面图谱。Bulk miRNA测序鉴定了耗竭CAR-T细胞与对照CAR-T细胞之间39个差异表达的miRNA。随后的逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证将候选列表缩减为18个miRNA，这些miRNA在细胞增殖相关通路中仍保持富集。为选择用于预测耗竭的最优生物标志物面板，我们进一步应用了基于功能分析的特征选择以最小化通路冗余，最终得出了六miRNA面板。使用这些miRNA的机器学习模型实现了优于更大面板的预测性能（曲线下面积=0.958）。我们的研究结果确定了miRNA作为CAR-T细胞耗竭的关键分子标志，并建立了生物标志物面板选择的理性框架，具有在CAR-T细胞质量控制、治疗效果预测和制造工艺优化方面的潜在应用。
引言
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液恶性肿瘤中取得了显著成功，并已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗B-ALL [1] 和DLBCL [2]。然而，由重复抗原刺激驱动的CAR-T细胞耗竭，表现为增殖能力和持续时间的降低，仍然是一个重大挑战，因为它往往导致不良的治疗结果，如疾病复发 [3, 4, 5, 6]。此外，耗竭被认为是将CAR-T细胞疗法扩展至实体肿瘤的主要障碍，在实体肿瘤中，持续性抗原暴露进一步加剧了CAR-T细胞耗竭 [7, 8]。
CAR-T细胞耗竭的标志包括激活诱导的细胞凋亡以及PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4等抑制性受体的过表达 [9]。然而，CAR-T细胞耗竭的分子特征仍未被完全理解。深入了解耗竭CAR-T细胞的分子特征对于预测和改善其治疗效果至关重要。为此，最近通过重复抗原刺激再现耗竭的体外模型已被作为揭示其分子图谱的有力工具 [10, 11]。例如，Good等人证明CAR-T细胞耗竭与向NK样表型的转变相关，并鉴定了该过程的关键调节因子，表明敲除这些基因可以改善治疗效果 [10]。由于耗竭是由多种分子层次之间的相互作用驱动的，多种分析方法如RNA-seq [12, 13] 和ATAC-seq [11, 14] 已被广泛用于鉴定CAR-T细胞耗竭的新标志。
在涉及各种生物现象（包括CAR-T细胞耗竭）的众多分子类别中，微小RNA（miRNA）作为潜在生物标志物尤其具有前景 [15, 16]。miRNA是小分子非编码RNA，通过靶向信使RNA（mRNA）调节基因表达，从而调控关键细胞过程 [17, 18, 19, 20]。它们在CAR-T细胞功能中的作用，包括增殖 [21, 22]、分化 [23] 和细胞因子分泌 [24]，已逐步得到表征。例如，miR-155有助于T细胞的持续性、扩增和抗肿瘤活性，也已被证明可以增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能 [21]。尽管取得了这些进展，但miRNA在CAR-T细胞耗竭中的调控分子图谱仍基本未定义。这一局限主要是由于此前缺乏能够再现CAR-T细胞耗竭的稳健实验模型。只有随着近期体外重复抗原刺激模型的开发，才有可能研究与耗竭相关的分子变化 [10]。此外，由于miRNA序列长度较短，全面的miRNA分析在技术上仍具挑战性。据我们所知，仅有一项研究直接检查了CAR-T细胞中的全局miRNA表达谱；然而，该分析并未研究耗竭CAR-T细胞，而是研究了IL-7刺激的CAR-T细胞以促进增殖 [22]。
在此，我们首次利用体外重复抗原刺激模型呈现了耗竭CAR-T细胞的全面miRNA表达谱（图1A）。从测序数据中初步鉴定出39个miRNA，随后通过逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证和基于功能分析的特征选择进行进一步筛选。该方法使我们能够构建生物标志物面板，并证明所鉴定的miRNA对CAR-T细胞耗竭的预测潜力。我们的发现揭示了CAR-T细胞耗竭的新标志，这些标志可作为区分耗竭CAR-T细胞和改善其治疗效果的有力工具。
章节摘要
材料
人外周血单核细胞（PBMC）购自Precision for Medicine, GmbH（德国柏林）。Roswell Park纪念研究所（RPMI）-1640、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、青霉素-链霉素（P/S）、丝裂霉素C、IL-2、IL-15、牛血清白蛋白（BSA）和磷酸盐缓冲液（PBS）购自FUJIFILM和光纯药株式会社（日本大阪）。胎牛血清（FBS）购自biosera（法国Cholet）。RetroNectin、NucleoSpin miRNA……
体外抗原刺激下耗竭CAR-T细胞的生成与表征
为建立具有重复抗原刺激的体外CAR-T细胞耗竭模型，我们通过逆转录病毒将抗CD19 CAR转导至人PBMC中生成CAR-T细胞。通过将CAR-T细胞与表达CD19的人类白血病B细胞（NALM-6）混合进行重复抗原刺激，如图1A所示。作为对照，CAR-T细胞在CAR转导五天后进行CD8和NGFR染色分选，不进行抗原刺激，然后作为对照CAR-T细胞进行评估……
讨论
CAR-T细胞耗竭是实现持久治疗反应的关键问题，尤其是在持续抗原刺激下。尽管此前涉及多种分子分析方法的研究大大促进了我们对CAR-T细胞耗竭的理解，但miRNA的作用基本未被探索。在本研究中，我们首次利用体外重复抗原刺激模型呈现了耗竭CAR-T细胞的全面miRNA图谱，并提出……
结论
本研究首次利用体外重复抗原刺激模型提供了耗竭CAR-T细胞的全面miRNA表达谱，并引入了一种新的miRNA标志物面板选择框架，该框架整合了无偏分析、实验验证和功能分析。通过在通路水平系统性地减少特征冗余，我们确定了一个由六个miRNA组成的面板，该面板能够区分耗竭与非耗竭CAR-T细胞。我们的发现突显了……
CRediT作者贡献声明
Risa Hamada：写作-审阅与编辑，调查，形式分析。Hiromasa Kaneko：写作-审阅与编辑，软件，方法论。Hyemin Seo：写作-审阅与编辑，验证，调查，形式分析。Yuki Kagoya：写作-审阅与编辑，资源，方法论，资金获取。Seiichi Ohta：写作-审阅与编辑，监督，项目管理，方法论，资金获取，概念化。Noriko Nakamura：写作-原稿……
竞争性利益声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能已经或似乎影响了本文所报告的工作。
致谢
我们感谢东京大学药学部未来药物发现一站式共享设施中心提供的流式细胞仪。超级计算资源由东京大学医学研究所人类基因组中心提供。本研究得到了JST PRESTO（资助号JPMJPR20A1）、JST FOREST（资助号JPMJFR234J）、JSPS KAKENHI（资助号21H01722、21H05092和21K20478）、JSPS核心到核心……
Noriko Nakamura | Hyemin Seo | Risa Hamada | Hiromasa Kaneko | Yuki Kagoya | Seiichi Ohta
东京大学工程创新研究所，日本东京都文京区弥生2-11-16，邮编113-8656
