等离子体活化水的特性及其对恶性黑色素瘤细胞凋亡的影响

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Characteristics of plasma-activated water and its effect on apoptosis of malignant melanoma cells

　　

摘要

等离子体活化水（PAW）因其丰富的活性氧和活性氮物种（RONS）含量，已成为一种颇具前景的间接冷大气等离子体癌症治疗手段，但其在恶性黑色素瘤中的效应及潜在机制仍有待进一步阐明。本研究将去离子水分别暴露于氦气大气压等离子体射流（APPJ）照射1、2、3、4和5分钟，制备五种PAW（PAW1、PAW2、PAW3、PAW4、PAW5）。对PAW的理化特性分析表明，随着APPJ照射时间的延长，电导率逐渐升高，pH值逐步下降，过氧化氢（H₂O₂）、亚硝酸盐（NO₂^?）和硝酸盐（NO₃^?）含量持续累积。与对照组相比，PAW处理后恶性黑色素瘤细胞（B16）活力呈时间依赖性降低，同时细胞凋亡增加，乳酸脱氢酶释放量升高。氧化应激标志物显示丙二醛（MDA）含量显著增加，超氧化物歧化酶（SOD）活性逐步下降。PAW5处理对B16细胞表现出最强的细胞毒性效应。Western blot分析显示抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调，同时促凋亡蛋白Bax持续上调。随后观察到裂解的caspase-9和裂解的caspase-3显著激活，表明线粒体凋亡途径被诱导启动。上述结果表明，PAW诱导的氧化应激触发了黑色素瘤细胞的线粒体凋亡途径，支持了PAW作为恶性黑色素瘤新型治疗策略的潜力。

引言

黑色素瘤源自皮肤中的黑色素细胞，是最致命的皮肤肿瘤之一，具有高度恶性[[1], [2], [3]]。据报道，到2040年，该疾病预计将新增约510,000例病例并导致96,000人死亡[4]。迄今为止，手术切除、放射治疗、化疗和免疫治疗等多种方法已被应用于黑色素瘤患者。然而，由于黑色素瘤对多种试验性方案具有耐受性，加上诸多副作用及高昂的试验费用，治疗效果并不令人满意[5,6]。因此，有必要开发比传统临床方法更快起效的、更具创新性和有效性的黑色素瘤辅助治疗方法[7,8]。

在过去十几年中，在大气压和近室温条件下产生的冷大气等离子体（CAP）作为一种有前景的非热技术，已被研究用于黑色素瘤细胞的治疗[[9], [10], [11], [12], [13], [14]]。众所周知，CAP是一种高度活泼的离子化物理状态，包含电子、离子、中性原子、活性氧物种（ROS）、活性氮物种（RNS）、电场、紫外线（UV）辐射和热量[15]。由于具有多重效应，CAP直接处理在体外和体内均可有效诱导指定部位黑色素瘤细胞的致命性损伤[16,17]。

近期，通过接触CAP生成的等离子体活化水（PAW）已被应用于各种类型癌细胞的治疗[[18], [19], [20]]。Subramanian等利用介质阻挡放电等离子体源和环境空气作为等离子体形成气体制备PAW，并研究了PAW添加对乳腺癌细胞（MDA-MB-231）细胞活力的影响[21]。Raud等通过大气压氩等离子体射流在受控环境气体中的去离子水中产生活性物种，制备了仅含ROS或同时含ROS和RNS的PAW。利用乳腺癌（4T1）和前列腺癌（PPC-1）细胞系，他们发现两种细胞系对PAW的敏感性相似[22]。Muttiah等研究了PAW对HCT-116结肠癌细胞的抗癌效应。他们发现PAW诱导的活性氧释放反映了细胞应激状态，凋亡标志物、DNA片段化以及热休克蛋白的增加标志着复杂的细胞反应[23]。Zhang等报道了利用等离子体活化微纳米气泡水（MNBs-PAW）进行癌症治疗的一种有前景的策略。他们发现NO₂^?、ONOO^?/O₂^?、OH和¹O₂的水平显著升高，而H₂O₂浓度略有下降。升高的RONS水平及其协同氧化还原反应导致A549癌细胞内ROS水平显著累积[24]。Mahdikia等以氦等离子体射流作为冷等离子体源制备PAW。他们发现CAP可以在水中产生一定浓度的抗癌物质，并通过激活caspase-3途径诱导黑色素瘤细胞凋亡[25]。这些研究结果表明，PAW不仅表现出显著的抗癌抑制作用，而且克服了CAP直接处理穿透深度浅的局限[15]。

尽管PAW已成为等离子体医学领域的研究热点，但关于PAW特性及其抑制恶性黑色素瘤细胞机制的研究仍相对有限。因此，本研究探讨了PAW中理化特性及水中活性氧和活性氮物种（RONS）的生成趋势。选用大气压等离子体射流（APPJ）制备PAW，因其具有良好的放电稳定性、易于操作实施，且可通过调节气体组成、流量和放电参数灵活调控气相活性粒子的种类。放电过程中产生的气相RONS可通过扩散、对流和溶解等传质过程在气液界面进入液相，从而引发化学反应。此外，还探讨了PAW诱导黑色素瘤细胞凋亡的机制。本研究旨在为优化PAW制备方案以潜在应用于癌症治疗提供科学依据和支持。

章节摘要

PAW的制备及其特性

本研究中，将体积为3 mL的无菌去离子水置于培养皿（Φ = 35 mm）中，使用先前报道的大气压等离子体射流（APPJ）装置进行照射以制备PAW [26]。如图1(a)所示，空心石英管（长10 cm，外径0.6 cm，内径0.2 cm）用作管道和介质屏障。有源电极和接地电极为宽1.0 cm的铜条，包裹在管外，两者之间的距离

PAWs的特性

采用不同APPJ照射时间制备的PAWs的理化特性和活性物种浓度如图2所示。由图2(a)可见，pH值从6.94 ± 0.09（对照组）逐步下降至3.07 ± 0.08（PAW5）。在我们的实验设计中，PAWs被稀释至完全细胞培养基中20%的浓度。由于完全培养基固有的缓冲能力，PAWs的加入并未改变

讨论

本研究结果表明，采用逐步增加APPJ照射时间（1–5分钟）制备的PAW对恶性黑色素瘤细胞表现出强效的、时间依赖性的细胞毒性和促凋亡作用。PAWs的理化特性显示水中RONS逐渐累积，同时电导率升高，pH值下降。这些变化与等离子体-液体相互作用的化学过程一致，其中在气相中产生的活性物种（

结论

总之，本体外研究提供了全面的证据，表明采用逐步增加APPJ照射时间制备的PAW对恶性黑色素瘤细胞表现出强效的、时间依赖性的细胞毒性和促凋亡作用。该活性的理化基础在于H₂O₂、NO₂^?和NO₃^?的逐步累积，以及酸性的增强。同时LDH释放量和MDA水平的升高，以及SOD活性的显著消耗，表明PAW

CRediT作者贡献声明

陈明燕：原稿撰写、方法论、调查研究、数据整理、概念构思。王晨红：软件、调查研究、正式分析、数据整理。陈正：指导、项目管理、方法论。许桂敏：审稿与编辑、验证、指导。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在合理要求下从通讯作者处获取。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

陈明燕|王晨红|陈正|许桂敏

浙江大学医学院附属儿童医院，中国浙江杭州，310003