去氢荷叶碱联合氟康唑对耐药白色念珠菌的协同抗真菌活性及作用机制

《Microbiology Spectrum》：Synergistic antifungal activity and mechanisms of dehydronuciferine combined with fluconazole against drug-resistant Candida albicans

　　

白色念珠菌（Candida albicans）对传统抗真菌药物的耐药性不断增强，构成重大临床挑战，凸显了开发新型治疗策略的迫切需求。药物联合治疗已成为克服抗真菌耐药性的有前景途径。本研究评估了天然阿朴啡类生物碱去氢荷叶碱（dehydronuciferine, DHN）与氟康唑（fluconazole, FLC）联用对6株临床耐药白色念珠菌分离株的协同抗真菌活性。棋盘式微量稀释法证实强协同作用，分数抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FICI）为0.063至0.265。值得注意的是，对于CA10株，FLC的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）在DHN存在下由>512 μg/mL降至0.25 μg/mL（FICI=0.125），即耐药性的逆转超过2,000倍。在蜡螟（Galleria mellonella）感染模型中，DHN+FLC联合用药较任一单药显著提高幼虫存活率（P<0.01）。表型实验显示，该联合用药明显抑制菌丝生长、生物膜形成和上皮质黏附等关键毒力特征。转录组分析揭示上述表型改变与菌丝及黏附相关基因、麦角固醇生物合成通路的下调相关。综上，这些发现表明去氢荷叶碱是一种有前景的抗真菌化学增敏剂，通过对耐药与毒力相关过程的多靶点扰动增强FLC对耐药白色念珠菌的疗效。需进一步机制和临床前研究以评估其转化潜力。 重要性：耐药白色念珠菌感染愈发难治，新抗真菌药管线有限。研究人员表明天然阿朴啡类生物碱DHN与FLC协同，通过同时抑制菌丝生长、生物膜形成和上皮质黏附，强效抑制耐药白色念珠菌。在蜡螟感染模型中，DHN–FLC组合较单药显著改善存活。这种将已批准抗真菌药与天然化合物配对的组合策略，为对抗抗真菌耐药提供了新路径，并可在不必开发全新药类的情况下加速替代治疗选项。

研究背景方面，侵袭性真菌感染（invasive fungal infections, IFIs）每年导致全球多达375万死亡，其中侵袭性念珠菌病是最常见的医院相关侵袭性真菌感染。白色念珠菌（Candida albicans）占医院念珠菌分离株约40%–80%，可被世界卫生组织列为“critical priority”真菌病原体。氟康唑（fluconazole, FLC）因广谱、口服生物利用度高和安全性好成为一线用药，但长期广泛使用使白色念珠菌对FLC耐药上升，部分地区阴道分离株耐药率可达71.5%。FLC耐药呈多因素：ABC转运蛋白Cdr1/Cdr2和MFS转运蛋白Mdr1过表达降低胞内唑类蓄积；ERG11（编码羊毛固醇14α-去甲基化酶）突变或表达改变削弱FLC结合并重塑膜固醇组成；生物膜通过限制药物渗透、代谢适应和持久细胞形成产生耐受；分子伴侣Hsp90激活促进耐药表型维持。这些机制常共存，因此需能同时靶向多条耐药相关通路的组合策略。天然生物碱因结构多样和药理活性广受关注，阿朴啡类异喹啉生物碱如小檗碱（berberine）和血根碱（chelerythrine）已被报道有抗真菌或增敏作用，但去氢荷叶碱（dehydronuciferine, DHN）是否抗白色念珠菌或增强FLC疗效此前未知。研究人员由此系统评价DHN联合FLC对耐药白色念珠菌的体内外活性并探索机制。

主要关键技术方法方面，研究人员使用来自山东省级医院的6株临床耐药白色念珠菌，以CLSI M27-Ed4棋盘法测体外协同并用FICI判读，以蜡螟（Galleria mellonella）感染模型做体内疗效与PAS组织学观察，以菌丝、结晶紫与MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）生物膜、16HBE支气管上皮黏附实验做毒力表型评价，以RNA测序（RNA-seq）做转录组与GO/KEGG富集分析。

研究结果方面，DHN combination with FLC exhibits synergistic antifungal activity against planktonic drug-resistant C. albicans in vitro：棋盘法显示DHN单药活性有限，而DHN–FLC在DHN 0.25–2 μg/mL、FLC 0.25–8 μg/mL范围强协同，FICI 0.063–0.265；CA10的FLC MIC由>512降至0.25 μg/mL，纸片扩散也见联合抑圈明显增大。DHN combined with FLC improves therapeutic efficacy in a G. mellonella infection model：蜡螟经CA10致死量感染后经DHN、FLC或联合治疗，单药较对照组存活无显著改善，联合组第4–5天存活率明显提高（P<0.01），PAS切片显示联合组真菌结构更少。DHN combined with FLC suppresses virulence-associated phenotypes of drug-resistant C. albicans：RPMI 1640诱导下未处理组大量长菌丝，联合组菌丝更短更少；结晶紫和MTT显示联合呈剂量依赖降低生物膜生物质与代谢活性；16HBE实验显示联合显著降低平均荧光强度和真菌黏附面积比。Transcriptomic analysis identifies pathways associated with the synergistic activity of DHN and FLC：RNA-seq显示联合组与对照差异基因富集于菌丝形态发生（ALS家族、ECE1、UME6）、GPI锚定细胞壁蛋白生物合成（PGA家族）和麦角固醇生物合成（ERG家族）；ALS3、HWP1、ECE1下调对应菌丝与生物膜抑制，GPI锚定黏附素改变对应上皮黏附下降，ERG基因改变提示膜组织变化增强FLC敏感。

讨论部分总结：研究人员指出FLC耐药由外排、麦角固醇合成改变、生物膜耐受和应激通路共同驱动，DHN联合FLC首次被证明可显著恢复耐药白色念珠菌对FLC的敏感，并在蜡螟模型有生物学意义疗效，但蜡螟不能替代哺乳动物毒理与药代评价。表型上联合抑制黏附、菌丝化和生物膜，利于FLC进入并起效；转录上协调下调菌丝、GPI锚定黏附素和麦角固醇相关基因，提示多通路而非单靶点。与glaucine、chelerythrine、berberine相比，DHN表现更广的增敏与毒力抑制谱。研究人员也说明局限：CA10等菌株ERG11、TAC1、MRR1、UPC2等耐药背景未全表征，RNA-seq仅为关联而非因果，后续需靶向遗传操作、全基因组测序和哺乳动物模型验证。

结论部分翻译：总之，本研究证明天然阿朴啡类生物碱DHN在体外和蜡螟感染模型中对耐药白色念珠菌与氟康唑具有协同作用。增强的抗真菌活性与菌丝形态发生、生物膜形成和上皮质黏附的抑制，以及细胞壁组织和麦角固醇生物合成相关通路的转录改变相关。这些发现将DHN确定为一种有前景的抗真菌化学增敏候选物，具有提高FLC对耐药白色念珠菌疗效的潜力。未来研究应优先考虑哺乳动物细胞毒性和药代动力学评价，以及靶向功能实验来验证所提机制，作为评估该组合策略转化潜力的关键步骤。论文发表于《Microbiology Spectrum》。