《Biochemical Engineering Journal》：AQDS-Mediated Electron Bifurcation Modulates Metabolic Shifts in Simulated Food Waste Anaerobic Digestion Under Different Organic Loadings
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•在低有机负荷（0.75克/升·天）下，AQDS通过类黄素和EB复合物的积累诱导基于黄素的EB过程•加入AQDS后，形成了细菌–EB–古菌之间的协同电子传递网络•在低有机负荷条件下，随着ATP和ATP合成酶活性的提高，甲烷产量增加了16.2%•富集了具有功能的微生物，以加速电子传
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在低有机负荷（0.75克/升·天）下，AQDS通过类黄素和EB复合物的积累诱导基于黄素的EB过程
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加入AQDS后，形成了细菌–EB–古菌之间的协同电子传递网络
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在低有机负荷条件下，随着ATP和ATP合成酶活性的提高，甲烷产量增加了16.2%
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富集了具有功能的微生物，以加速电子传递和VFA降解
引言
厌氧消化（AD）是将有机废物转化为有用资源的关键技术。通过微生物的协同作用，它将食物废物和其他有机材料转化为甲烷。这一过程不仅处理了废物，还回收了可再生能源，使其成为可持续废物管理的重要组成部分[1]，[2]。然而，传统的AD系统面临着两个持续的挑战：电子传递效率低和能量损失大。具体来说，通过氢或甲酸盐的种间电子传递在动力学上缓慢且在热力学上受限。同时，微生物消耗大量ATP来驱动需要能量的反应，如二氧化碳还原，这限制了甲烷生产的进一步改进[3]。克服这些挑战需要采取策略来提高电子传递效率并优化不同操作条件下的微生物能量分配。
AD中的微生物能量代谢高度依赖于环境条件，其中有机底物的可用性——即有机负荷——是决定代谢策略的关键因素。本研究中高有机负荷（1.5克/升·天）提供了丰富的可发酵物质，支持微生物的快速生长和活性。在这种条件下，微生物主要通过底物水平的磷酸化产生能量，充足的底物被迅速分解以产生ATP，而种间氢或甲酸盐传递等电子传递途径足以支持甲烷生产。相比之下，低有机负荷（0.75克/升·天）虽然也提供了足够的营养物用于生长，但将微生物代谢的重点从快速底物分解转向更有效的能量利用。在这种条件下，由于可发酵物质的不足，底物水平的磷酸化效率降低，导致微生物进入近乎饥饿的状态，从而促使它们激活替代的能量耦合机制以存活[4]。在这些机制中，电子分叉（EB）是一种关键的适应策略。
EB是一种在厌氧微生物中发现的独特能量耦合机制。在这个过程中，一个酶复合体将一对电子分成两个不同的路径。一个电子转移到具有高氧化还原电位的受体上，如NAD?或丙酮酸。另一个电子从具有高电位的供体上分支出来，如NADH或F???H?，然后转移到具有低氧化还原电位的受体上，如还原型的铁氧还蛋白。这种设置允许来自自发反应的能量驱动那些原本需要能量输入的反应[5]。还原型的铁氧还蛋白作为关键的电子载体，支持ATP生产和甲烷的形成[6]。例如，在产甲烷古菌中，HdrABC-MvhAGD酶复合体同时氧化F???H?并还原铁氧还蛋白，即使还原步骤在能量上是不利的。这种机制大大提高了能量效率，理论上每处理一摩尔底物可以节省0.25到0.5摩尔的ATP[7]。
尽管EB通常在底物有限的情况下被激活，但其效率受到种间电子传递（IET）的密切限制，即微生物之间的电子交换。在底物变得有限的条件下，IET成为EB的瓶颈。底物的减少降低了H?和甲酸盐的产量，而这些是IHT和IFT的主要载体。同时，天然电子穿梭体的水平较低，如微生物产生的类黄素，限制了直接的种间电子传递（DIET）。这种电子的缺乏削弱了EB的活性，因为执行EB的酶复合体（如HdrABC-MvhAGD和Etf/Bcd）缺乏足够的电子供体或受体来有效运作。因此，要在这种条件下充分发挥EB的潜力，需要改善介导的种间电子传递（MIET），特别是使用能够补偿天然电子载体短缺的电子穿梭体。
电子穿梭体是具有氧化还原活性的化合物，有助于在细胞膜之间以及细胞之间传递电子。它们通过改善电子向EB酶复合体的传递来间接调节EB过程。例如，零价铁（ZVI）增强了DIET，并促进了细胞外电子载体（如类黄素）与EB酶复合体（如HdrABC-MvhAGD）之间的功能连接。这为EB过程提供了更有效的电子分配，并改善了整体能量代谢[7]。同样，热解碳材料（如生物炭）已被证明可以增加细胞外类黄素的可用性，并通过膜结合的复合体（如Rnf复合体）促进电子传递。这激活了Etf/Bcd复合体中的EB功能，提高了铁氧还蛋白还原的效率，并有助于平衡NADH/NAD?循环[8]。在人工电子穿梭体中，基于醌的化合物AQDS具有独特的优势。它通过重复的AQDS/AQDSH?氧化还原循环加速电子的转移。在天然类黄素稀缺的条件下，AQDS在微生物细胞和EB酶复合体之间充当桥梁，填补了电子传输网络的空白。它增强了依赖类黄素和醌的电子向EB复合体（如HdrABC-MvhAGD）的传递，确保了EB的稳定电子供应[7]，[8]，[9]。同时，AQDS促进了发酵细菌和产甲烷菌之间的直接电子传递，进一步刺激了EB的活性。具体来说，高效的电子流动为EB提供了更多的高电位电子供体（如NADH），而EB产生的还原型铁氧还蛋白支持了产甲烷菌的代谢。这种协同作用直接减少了在底物有限条件下的能量需求反应的能量损失[8]。
为了应对不同代谢状态下AD中的能量生产瓶颈，本研究使用AQDS作为电子穿梭体来增强IET并激活基于类黄素的电子分叉。使用模拟食物废物作为底物，我们结合了半连续消化试验、酶活性检测、电化学测试和宏基因组测序来实现分层研究目标：主要目标是阐明在不同有机负荷下AQDS介导的EB激活的核心机制，而次要目标包括表征AQDS诱导的共生微生物群落的变化，并量化关键能量代谢指标的变化，包括甲烷产量、ATP浓度和ATP合成酶活性。我们的结果表明，在低有机负荷下，AQDS驱动代谢向以EB为主的能量保存转变，并显著提高了整体AD性能，为有机废物厌氧处理系统的优化提供了理论和技术参考。
部分摘录
底物和接种物
为了避免底物组成的变化，本研究使用了根据我们之前工作描述的方法制备的模拟食物废物[10]。每种混合物包含600克蒸米、450克绿色蔬菜、300克瘦猪肉和150克豆腐。这些材料被煮熟后用研磨机粉碎，并在搅拌机中混合。最后加入蒸馏水，使总体积达到3.0升，用于AD实验。接种物取自唐家沱的一个厌氧消化器
AQDS对突然降低有机负荷下甲烷产量的影响
在高有机负荷（1.5克/升·天）运行的前60天内，添加了AQDS的组（A1）的每日甲烷产量达到320.1毫升/克·天，仅比对照组（C1，310.1毫升/克·天）高3.3%（图1a）。在这个阶段，AQDS可能主要作为电子穿梭体，通过种间电子传递调节微生物的代谢活性，从而略微提高了底物转化率和甲烷产量[19]，[20]。这
结论
本研究表明，AQDS在厌氧消化中起到了有效的代谢调节作用，其作用取决于主导的代谢条件。在高负荷条件下，当底物水平磷酸化占主导时，AQDS的作用不大。然而，当有机负荷降低时，AQDS将微生物代谢转向以EB为主的能量保存。AQDS激活了基于黄素的EB过程，这通过类黄素的积累、Etf/Bcd和Hdr的表达上调得到了证实
CRediT作者贡献声明
Shang Cheng：可视化、调查。Yongdong Chen：软件、概念化。Li Gu：写作 – 审阅与编辑、监督、概念化。Binquan Jiao：资金获取。Wenjing Zhang：项目管理。Liwen Zheng：数据管理。Xueyu Zhao：写作 – 初稿、验证、方法学、正式分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们要感谢相应作者Li Gu、Binquan Jiao和Shang Cheng在整个研究过程中的宝贵指导和支持。这项工作得到了重庆市自然科学基金项目（cstc2022NSCQ-MSX0567）和重庆大学科技计划（2022CDJYGRH-008）的财政支持。
Xueyu Zhao|Wenjing Zhang|Liwen Zheng|Li Gu|Binquan Jiao|Shang Cheng|Yongdong Chen
