青霉属蛋白酶抑制物质的纯化与结构鉴定及真菌形态对其形成的影响

《Biochemical Engineering Journal》：Purification and structural elucidation of a protease-inhibiting substance from Penicillium sp. and the influence of fungal morphology on its formation

　　

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  由Penicillium sp. 产生的次级代谢产物壳质宁B（cathestatin B）
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  具有不可逆且选择性作用模式的强效半胱氨酸蛋白酶抑制剂
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  形态学分析表明，颗粒的壳层结构与更高的产量相关。

引言

真菌在其代谢过程中能够产生具有药用价值的次级代谢产物，例如抗生素。在实现大规模抗生素生产（如青霉素和头孢菌素）之后，对真菌培养的科学和技术兴趣逐渐下降。然而，近年来，这一趋势出现了逆转。这主要是由于细菌对已有抗生素的耐药性日益增强，促使人们必须寻找新的抗生素。近年来，针对既往无法治疗的疾病寻找活性物质的研究也再次将关注点转向真菌，因为真菌根据生长条件和环境因素不同，可以产生几乎无法统计数量的次级代谢产物。

丝状真菌的形态在生物反应器中培养时可以从颗粒形态（具有核心团聚体）到游离菌丝体而变化。理想的形态因菌株和目标产物不同而异，因为它对时空产率有显著影响 0 [1]。酶的生成主要发生在菌丝快速延伸和活跃生长期，而次级代谢产物则在受到限制、生长极缓慢至零生长的阶段产生 [2]。游离菌丝体生长迅速，培养液粘度很高，导致培养基中的底物或氧气等质量传递受限。以颗粒形态生长时培养基粘度最低，但颗粒内部的菌丝网络可能导致颗粒核心出现底物限制。研究人员已针对多种微生物研究了在培养过程中影响形态的各种方法——包括培养基成分、添加剂和pH值，以及接种物中的孢子浓度、搅拌和通气等。为了优化真菌工艺，理解形态是必须考虑的重要方面。

Soerjawinata 等 [3]、[4]、[5] 报道了在适当培养条件下，真菌Penicillium sp.（IBWF 040-09）在次级代谢中形成一种物质。该物质能够抑制寄生虫Trypanosoma brucei分泌的一种蛋白酶，该寄生虫会导致感染宿主（即人类）患非洲睡眠病（人类非洲锥虫病，HAT）。该物质在真菌体内形成，可通过细胞裂解后提取获得 [3]。然而，只有在真菌以颗粒形态生长时，才能充分产生该物质 [4]。这似乎是由于颗粒内部的养分供应受到扩散控制性限制所致，而只有在这种形态下才会发生。然而，直到现在，这种蛋白酶抑制物质的确切身份、结构和作用机制一直未知，仍需阐明。

为了实现Penicillium sp.（IBWF 040-09）产生的代谢产物的结构解析和作用机制研究，第一步开发了一种色谱方案，利用该方案可以从真菌生物质提取物中以所需数量和纯度分离出该物质（见3.1节）。随后使用LC-MS/MS对其结构进行了阐明（见3.2节）。所确定的结构对应于分子壳质宁B，该分子已被知晓一段时间，但迄今受到较少关注。由于壳质宁B也可以通过化学方法生产，因此建立了相应的化学合成方法（见3.3节）。通过该化学合成获得的壳质宁B验证了蛋白酶抑制效果和质谱分析结果。此外，还阐明了其抑制机制（见3.4通过比较光谱和抑制行为进行命中验证，3.5壳质宁B结合模式分析）。此外，研究了颗粒的微观形态，结果表明颗粒中具有壳层结构的特定形态与提高产品产量相关（见3.6节）。进行了5倍放大实验，以证明在所需形态下进行放大的可行性（见3.7节）。

各节摘要

菌株和培养条件

Penicillium sp. IBWF（040-09）在琼脂平板上保存，接种用的孢子溶液按照Soerjawinata 等 [3] 所述方法制备。培养中的孢子浓度进行了变动，使用4.41 · 10³ Sp/L、4.41 · 10⁵ Sp/L或4.41 · 10⁷ Sp/L来影响颗粒大小和内部形态。接种物中较高的孢子浓度导致颗粒较小，而较低的孢子浓度则产生较大的颗粒 [5]。所有培养均在至少三个独立的生物学

蛋白酶抑制剂的色谱分离

Soerjawinata 等 [3] 之前的研究表明，通过反相色谱（RPC）可以从均质化真菌颗粒的粗提取物中获得具有蛋白酶抑制效果的组分。使用所用的方案，蛋白酶抑制物质在4.5 分钟至4.75 分钟之间的一个馏分中被洗脱；然而，无法实现基线分离的更好分辨率（见图3上部）。所有将该物质与馏分中其他成分分离的尝试

结论

总之，Penicillium sp.（IBWF 040-09）将壳质宁B作为次级代谢产物进行生产。通过与化学合成的壳质宁B进行比较确认了产物的结构，并通过实验和分子对接两种方式证明了其作用机制。虽然由于样本组数量有限，未能建立单一颗粒形态与总生产力之间的直接因果关系，但本研究的发现表明了一个趋势，即更高的壳质宁

资金

作者感谢莱茵兰-普法尔茨州对"ParaMorphoPharm"研究学院项目的支持。Tanja Schirmeister和Louis Pergaud Sandjo感谢CAPES-PROBRAL和DAAD对交流项目的资金支持（编号分别为88881.895028/2023-01和57704957）。

CRediT作者贡献声明

Isabelle Barth：撰写——原稿，可视化，方法论，调查研究，形式化分析，数据整理。Percy Kampeis：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，概念构思。Winda Soerjawinata：调查研究，数据整理。Geovanna de Oliveira Costa：撰写——原稿，形式化分析，数据整理。Patrick Müller：撰写——原稿，可视化，方法论，调查研究，形式化分析，数据整理。Collin Zimmer：撰写——

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢莱茵兰-普法尔茨州对"ParaMorphoPharm"Forschungskolleg项目的支持。我们还想感谢美因茨的生物技术和药物研究所（IBWF gGmbH）提供菌株Penicillium sp. IBWF（040-09）。

Tanja Schirmeister和Louis Pergaud Sandjo感谢CAPES-PROBRAL和DAAD对交流项目的资金支持（编号分别为88881.895028/2023-01和57704957）。

支持本文研究结果的数据

Isabelle Barth|Patrick Müller|Collin Zimmer|Winda Soerjawinata|Geovanna de Oliveira Costa|Annabelle Weldert|Louis Pergaud Sandjo|Christian Kersten|Tanja Schirmeister|Percy Kampeis