《Biochemical Pharmacology》：Palmatine blocks GAPDH K263 lactylation, thereby inhibiting glycolysis and osteogenic differentiation in calcific aortic valve disease
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摘要钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是一种常见的心血管疾病，目前尚无有效的药物治疗获批。本研究旨在探讨小檗碱（PAL）在CAVD中的治疗潜力，并阐明其潜在的分子机制，重点关注其在代谢-表观遗传学交互作用中的作用。采用qRT-PCR、Western blotting和茜素红S染色
摘要
钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是一种常见的心血管疾病，目前尚无有效的药物治疗获批。本研究旨在探讨小檗碱（PAL）在CAVD中的治疗潜力，并阐明其潜在的分子机制，重点关注其在代谢-表观遗传学交互作用中的作用。采用qRT-PCR、Western blotting和茜素红S染色，在人主动脉瓣间充质细胞（hVICs）中评估了PAL的抗钙化作用。整合多组学分析（转录组和代谢组学）以及乳酸化组学分析发现，PAL主要通过干扰糖酵解代谢和全局赖氨酸乳酸化水平发挥作用。通过分子对接和表面等离子体共振（SPR）技术评估了PAL与磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的相互作用。利用定点突变技术研究GAPDH K263乳酸化（K263lac）的功能意义。PAL处理显著抑制了hVICs的成骨分化和钙化。在机制上，PAL直接与GAPDH结合，选择性地降低其K263残基的乳酸化水平。将K263突变为精氨酸（K263R）模拟了PAL的作用，消除了PAL介导的对糖酵解、成骨基因表达和钙沉积的抑制作用。免疫荧光分析进一步证实，PAL处理显著降低了细胞质中K263lac的水平，而K263R突变完全消除了这种修饰。在体内实验中，高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠模型中给予PAL，通过超声心动图和von Kossa染色证实显著减轻了主动脉瓣钙化。总之，GAPDH K263lac是CAVD中一个新型的可药靶点。通过直接靶向该修饰，小檗碱破坏了糖酵解和成骨分化过程，突显了其在CAVD治疗中的应用潜力。
引言
钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是主动脉瓣叶片的进行性纤维钙化性病变，常导致主动脉瓣狭窄和心力衰竭；然而，目前尚无获批的药物能够阻止或逆转其进展[1]。一旦CAVD达到晚期阶段，手术或经导管瓣膜置换仍然是唯一有效的选择，但该方法存在较大的手术风险和有限的瓣膜耐久性[2]、[3]。因此，迫切需要识别新的分子靶点并开发基于机制的CAVD治疗策略。
越来越多的证据表明，代谢重编程——特别是向有氧糖酵解的转变（即Warburg效应）——在驱动人主动脉瓣间充质细胞（hVICs）的成骨分化中发挥着关键作用，这是CAVD的主要致病事件[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。我们之前的工作表明，在CAVD条件下，即使在常氧环境中，hVICs也表现出显著的糖酵解通量和乳酸产生增加[9]。乳酸不仅是代谢燃料，还作为赖氨酸乳酸化（Kla）的前体，而Kla是一种最近发现的连接细胞代谢与表观遗传调控的翻译后修饰[10]。重要的是，我们和其他研究者已表明，组蛋白和非组蛋白Kla都能促进CAVD中Runx2和BMP2等成骨基因的表达[11]、[12]。在糖酵解酶中，磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）已被确定为代谢-表观遗传学交互作用的一个潜在节点，因为在乳酸升高条件下，GAPDH常被Kla修饰[13]、[14]。然而，位点特异性的GAPDH Kla是否参与CAVD的发病机制以及能否通过药物靶向干预，目前仍不清楚。
小檗碱（PAL）是一种源自黄连等药用植物的异喹啉类生物碱[15]，具有明确的代谢调节活性，包括改善胰岛素敏感性、减少脂质积累和调节葡萄糖代谢[16]、[17]、[18]。PAL在临床前模型中还显示出抗炎和心脏保护效应[19]、[20]。鉴于CAVD是由类似于代谢综合征的糖酵解重编程所驱动的，我们假设PAL可能干扰hVICs中的代谢-表观遗传学轴。然而，PAL是否直接影响CAVD环境下的糖酵解重编程和乳酸化尚未得到研究。
在本研究中，我们检验了以下假设：PAL通过靶向GAPDH K263乳酸化，从而破坏hVICs的糖酵解和随后的成骨分化，进而缓解CAVD。通过整合多组学分析、分子对接、表面等离子体共振（SPR）和定点突变技术，我们证明PAL直接与GAPDH结合，选择性地降低其K263残基的乳酸化水平，并抑制糖酵解通量和成骨基因表达。此外，我们在CAVD的体内小鼠模型中验证了PAL的治疗效果。总之，我们的研究发现确定了GAPDH K263乳酸化作为一个可药靶点，并将小檗碱定位为用于CAVD药物治疗的首创先导化合物。
各节摘要
样本收集、细胞培养和处理
主动脉瓣样本来自三位（两男一女，年龄46-57岁）晚期心力衰竭并接受心脏移植的患者，移植手术在华中科技大学同济医学院附属协和医院（中国武汉）进行。所有患者均提供了书面知情同意。纳入标准为：(1)超声心动图确认主动脉瓣功能正常且无钙化；(2)计划进行心脏移植；(3)愿意捐赠切除的瓣膜组织。排除标准
PAL抑制hVICs的成骨分化
通过用不同浓度的PAL（0、1、5、10、20、50和100 μM）处理细胞，评估了PAL对hVICs活力的影响。CCK-8检测结果表明，与对照组相比，用20 μM PAL处理后细胞活力显著下降，且用50和100 μM PAL处理后抑制作用进一步增强（图1A）。后续分析表明，用20 μM PAL处理后细胞活力随时间（1、2、3、4和5天）逐渐下降（图
讨论
CAVD的特征是主动脉瓣叶片的进行性纤维钙化性重塑，损害心脏功能并增加死亡率[1]。尽管外科手术干预取得了进步，但目前尚无药物能够阻止或延缓疾病进展。在本研究中，我们证明PAL通过靶向GAPDH K263lac，从而破坏hVICs的糖酵解代谢和成骨分化，进而抑制CAVD进展，推进了我们对
CRediT作者贡献声明
杜倩倩：写作–审阅与编辑。吴佳琴：写作–初稿。王顺顺：数据整理。王思翔：软件。于慧明：数据整理。刘民福：概念构思。侯书婉：资源。江山：形式分析。徐华娇：验证。叶思怡：概念构思。陆一红：项目管理。陈琳：项目管理。李安正：项目管理。冯帆：指导。庞怡：调查。盘联宏：方法学、经费获取。Wang Chunli
伦理审批
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。本研究获得了华中科技大学同济医学院机构审查委员会（批准编号：20220271）和湖北中医药大学动物伦理委员会（批准编号：20240106013）的批准。
资金来源
本工作得到以下机构资助：国家自然科学基金（82574618）、湖北省自然科学基金（项目编号：2025AFD483）、湖北省中医药创新团队项目（ZY2025J002）、湖北省科技计划项目（2025BCB043）、湖北省自然科学基金（项目编号：2026AFA082）、非传染性疾病-国家科技重大专项（2024ZD0528200、2024ZD0528204），
利益冲突声明
作者声明，不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
杜倩倩|吴佳琴|王顺顺|王思翔|于慧明|刘民福|侯书婉|江山|徐华娇|叶思怡|陆一红|陈琳|李安正|冯帆|庞怡|盘联宏|王春丽|徐康
湖北中医药大学医学检验学院，中国武汉 430065
