PBX3促进出生后早期发育期间少突胶质前体细胞增殖与分化

《Journal of Developmental Biology》：PBX3 Promotes Oligodendrocyte Progenitor Cell Proliferation and Differentiation During Early Postnatal Development

　　

前B细胞白血病转录因子3（PBX3）是一种参与神经发育的TALE同源结构域蛋白，但其在少突胶质细胞（OL）分化中的功能此前尚未被探索。研究人员发现，PBX3表达在OL谱系进程中受到动态调控，在P14时胼胝体中表达达到峰值，对应活跃髓鞘形成的起始。在培养的原代少突胶质前体细胞（OPCs）中，PBX3表达在OL-1DIV（体外分化的早期阶段）达到峰值。利用OL谱系特异性Pbx3条件敲除小鼠，研究人员发现Pbx3缺失降低了P14和P27时胼胝体中SOX10⁺ OL谱系细胞和CC1⁺成熟OL的密度，并伴随MBP表达下降。值得注意的是，这些缺陷在P50时基本恢复，表明PBX3是一种年龄依赖性而非绝对的需求。EdU标记显示Pbx3 cKO小鼠中OPC增殖减少，但用于条件性敲除的Olig1-Cre驱动子在早期神经祖细胞中也有活性，因此不能排除OPC特化或生成减少的贡献。与此一致的是，在原代OPC中通过siRNA介导的Pbx3敲低在体外损害了分化并降低了MBP表达。总之，研究结果确定PBX3是出生后早期发育期间OL分化的正调控因子，具有时间限制性需求，并为CNS髓鞘形成的转录调控提供了见解。

PBX3作为少突胶质谱系发育的正向调控因子

中枢神经系统（CNS）髓鞘形成是神经发育的基本过程，少突胶质细胞（OL）生成髓鞘包绕轴突，保障动作电位快速跳跃传导并为神经元提供代谢支持。该过程依赖于少突胶质前体细胞（OPC）精确有序地分化为成熟髓鞘化OL，并持续至出生后阶段。OL分化受阻与多种神经系统疾病相关，如脑室周围白质软化、多发性硬化及脑缺血后白质损伤。目前已知OLIG1、OLIG2、SOX10、MYRF和NKX2.2等转录因子构成调控OL谱系进展的层级网络，但完整调控机制尚未阐明，尤其同源盒转录因子的作用认识不足。PBX家族（PBX1、PBX2、PBX3）属于TALE类同源结构域蛋白，是Hox蛋白的关键共因子。PBX3在CNS发育尤其OL生物学中的功能研究较少。近期单细胞转录组分析提示PBX3在缺血性脑损伤中参与PBX3/Dguok/Kif21b信号通路，改善大脑中动脉闭塞后的OPC功能障碍，但PBX3在正常CNS发育中对OL分化的生理功能仍未探索。因此，研究人员开展本研究，旨在明确PBX3在OL分化中的作用。

研究人员分析了PBX3在OL分化不同阶段的表达动态；构建OL谱系特异性Pbx3条件敲除（cKO）小鼠，在多个出生后时间点检查OL分化进程；并在培养的OPC中通过siRNA敲低Pbx3验证其功能。结果表明：PBX3表达在OL谱系进程中动态变化，体内胼胝体P14表达最高，体外OL-1DIV最高；Pbx3缺失导致P14和P27时SOX10⁺ OL谱系细胞密度和CC1⁺成熟OL比例显著降低，MBP表达下降，但P50时基本恢复；在体EdU标记显示Pbx3 cKO小鼠OPC增殖减少，TUNEL未见凋亡差异；体外Pbx3敲低损害OPC增殖和OL分化，降低Mbp表达。这些发现将PBX3确定为出生后早期发育中OL分化的正向调控因子，其需求具有时间限制性，为CNS髓鞘形成的转录调控提供了新见解。论文发表在《Journal of Developmental Biology》。

关键技术方法方面，研究人员采用Olig1-Cre介导的Pbx3条件敲除小鼠模型（Pbx3^fl/fl; Olig1-Cre^+/?），以同窝对照为比较组；从P6小鼠大脑皮层分离原代OPC进行体外培养。主要技术包括：qRT-PCR检测基因表达、Western blot检测蛋白水平、免疫荧光染色定量细胞密度和标志物、EdU掺入实验评估增殖、TUNEL实验检测凋亡，以及siRNA转染实现Pbx3敲低。样本均来自小鼠，每组n=3。免疫荧光定量采用双盲法，MBP荧光强度按年龄分别标准化。

研究结果如下：

Pbx3表达在少突胶质细胞分化过程中受到动态调控。研究人员通过qRT-PCR检测正常小鼠P7、P14、P21胼胝体Pbx3 mRNA，发现P14表达最高，对应活跃髓鞘形成的起始阶段。在原代OPC分化模型中，Pbx3表达自OPC至OL-1DIV升高并达峰，OL-3DIV略降；Western blot证实OL-3DIV中PBX3蛋白水平显著高于OPC。表明PBX3表达与OL分化正相关。

Pbx3缺失以发育阶段依赖性方式损害少突胶质细胞分化。利用Pbx3 cKO小鼠，Western blot证实P14胼胝体PBX3蛋白约减少50%。免疫荧光染色显示，P14和P27时cKO小鼠胼胝体和皮层中SOX10⁺细胞密度及CC1⁺成熟OL比例均显著低于对照；P50时两组无显著差异。MBP免疫荧光强度在P14和P27降低，P50恢复。提示PBX3对早期出生后OL分化重要，其缺失导致发育延迟。

Pbx3缺失在体内抑制OPC增殖。P1小鼠腹腔注射EdU，24h后分析胼胝体PDGFRα⁺细胞中EdU⁺比例。cKO小鼠PDGFRα⁺细胞密度降低，EdU阳性比例约20.8%，对照约55.5%。TUNEL染色未见凋亡差异。说明PBX3可能促进OPC增殖；但Olig1-Cre在早期神经祖细胞中有活性，不能排除OPC特化或生成减少的贡献。

体外Pbx3敲低损害OPC增殖和OL分化。研究人员设计三条siRNA，筛选出siRNA-Pbx3-307可使Pbx3 mRNA降至对照的58.8%。在分化条件下培养72h后，siRNA处理组Mbp mRNA水平显著降低，SOX10⁺细胞中MBP⁺细胞比例减少，EdU⁺细胞比例降低。体外结果支持PBX3在OL分化中的正调控作用。

讨论部分指出，PBX3作为TALE同源结构域蛋白，可能通过与其他OL谱系转录因子（如OLIG2、SOX10、MYRF）协同作用，调控OL分化相关基因表达。PBX3需求的时间窗（P14-P27）与小鼠胼胝体活跃髓鞘形成期重叠，提示其在快速产生成熟OL中发挥重要作用。P50时表型恢复可能涉及补偿机制，但qRT-PCR未检测到Pbx1和Pbx2 mRNA水平显著变化，不能排除蛋白水平补偿。研究也存在局限：PBX3的直接靶基因和相互作用因子未知；未定量分析各分化阶段的过渡；抗体限制导致无法直接观察组织切片中PBX3与OL谱系标志物的共定位。未来需通过ChIP-seq、谱系示踪和新型抗体进一步研究。研究结论为：PBX3是出生后早期发育期间OL分化的正向调控因子，以时间限制性方式促进OPC增殖和分化，参与CNS髓鞘形成的转录调控。