神经组织玻璃化后编码膜整合结构的转录本选择性低表达

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Selective under-representation of transcripts encoding membrane-integrated architectures following neural tissue vitrification

　　

低温保存对于生物组织的长期储存至关重要。然而，令人意外的是，低温保存对组织转录组的影响仍知之甚少。本研究采用批量RNA测序（bulk RNA sequencing, RNA-seq）检测保存方法（快速冷冻或玻璃化）如何影响小鼠大脑皮层和海马体的转录组。在玻璃化条件下处理的组织表现出一组数量虽小但结构连贯的转录本的选择性低表达，其中海马体比大脑皮层表现出更大的脆弱性。UniProt注释显示，受影响的转录本显著富集编码膜相关、分泌途径和多次跨膜拓扑结构的蛋白，表明结构复杂的膜整合结构可能对玻璃化过度敏感。使用iPANDA进行的通路水平分析进一步表明，玻璃化组织中的负保存评分主要集中在信号转导和代谢通路中，提示存在协调的通路水平破坏，而非全局性转录本丢失。这项工作突出了玻璃化过程中的分子脆弱性，并强调在优化神经系统的低温保存方法时需要进行转录本水平评估。

论文解读：神经组织玻璃化后的转录组选择性损伤

低温保存（cryopreservation）是生物技术中用于长期储存生物材料的基础技术，在基础研究、医学和保护生物学中应用广泛。快速冷冻（snap freezing）通过急速投入液氮实现分子组成的相对保留，但使样本丧失活性；玻璃化（vitrification）则利用高浓度冷冻保护剂（cryoprotective agent, CPA）和快速降温形成无定形玻璃态，可维持细胞结构完整性，甚至在某些器官中恢复功能。然而，玻璃化对组织转录组的影响仍缺乏系统评估，尤其是在结构复杂且对分子保真度要求极高的神经组织中。不同脑区（如大脑皮层和海马体）的细胞组成和细胞外基质结构存在显著差异，这可能导致对低温损伤的敏感性不同。目前器官水平的玻璃化策略通常假设单一CPA配方能均匀保护所有组织，但这一假设尚未得到转录组数据验证。因此，研究人员利用RNA-seq系统解析玻璃化与快速冷冻对小鼠皮层和海马体转录组的影响，以识别保存方法导致的分子偏差。

该研究使用来自三只成年雌性C57BL/6小鼠的皮层和海马组织，混合后分为新鲜、快速冷冻和玻璃化三组，每组设三个技术重复。玻璃化采用乙二醇、二甲基亚砜（DMSO）和蔗糖配制的梯度溶液进行CPA装载，液氮保存4天后快速复温并梯度脱除CPA。RNA经TRIzol匀浆后由华大基因（BGI）DNBSEQ平台完成双端150 bp测序，比对至GRCm38.p6参考基因组。生物信息分析包括主成分分析、层次聚类热图、火山图，使用PandaOmics中iPANDA算法进行通路评分，并利用UniProt注释对受影响转录本进行结构和定位分析。

结果显示，保存方法主导了转录组全局分离。主成分分析中第一主成分（PC1）解释96.20%的方差，玻璃化样本与快速冷冻样本显著分离。火山图显示，玻璃化比较中负log₂倍变化转录本明显增多，而快速冷冻造成的改变更小且更对称。这表明玻璃化对转录本丰度的影响更为广泛且偏向低表达。

系统级分析中，具有负iPANDA评分的通路数量在玻璃化后显著增加：海马体中玻璃化组有873条，快速冷冻组仅302条；皮层中分别为896条和130条。共享负分通路最多的功能类别包括信号转导、代谢、疾病相关、发育生物学和免疫系统。跨组织和条件共享的负分通路仅13条，且这些通路内基因的方向性并不一致，只有少数转录本表现出统一的保存或低表达模式，提示玻璃化引起的分子破坏具有通路选择性而非全局性。

进一步筛选快速冷冻下稳定、玻璃化后显著降低的转录本，海马体中鉴定出190个，皮层中104个，两者重叠14个。UniProt注释显示，这些转录本高度富集膜相关、分泌途径和多次跨膜蛋白编码基因。皮层中53.6%、海马中50.6%的受影响蛋白定位于膜或胞外；信号肽和跨膜片段分别在35.8%/32.6%（皮层）和25.6%/32.1%（海马）的蛋白中存在。海马中多次跨膜蛋白尤其丰富，其中54.0%含有两个以上螺旋，并出现明显的7次跨膜（7-TM）拓扑特征。此外，糖基化位点在海马受影响蛋白中占30.1%，多数同时为膜相关或信号肽阳性。这些结果揭示玻璃化可能优先损伤依赖内质网-高尔基体加工的结构复杂膜整合蛋白。

讨论部分指出，该研究观察到的选择性低表达与无脊椎动物和卵母细胞中的冷冻保存转录组变化趋势一致，支持膜整合及分泌途径蛋白在多种物种中的易损性。作者将玻璃化导致的分子脆弱性与缺血性损伤类比，因为海马在两种损伤下均表现出比皮层更高的敏感性。局限性包括使用批量RNA测序无法区分细胞类型，且单一玻璃化方案和固定储存时间限制了结论的普遍性。研究人员强调，虽然无法完全排除提取或建库中的技术偏倚，但所有样本均采用相同流程并表现出高质量测序指标。未来需结合电生理、线粒体功能、蛋白质组学及转运动物实验，进一步明确转录本低表达与功能保存的关系。

结论翻译：器官低温保存研究进展迅速，但其对转录组完整性的影响仍很大程度上未被探索。本研究表明，玻璃化条件与编码膜整合和分泌途径蛋白的转录本选择性低表达相关，揭示了一个无法仅通过形态学或功能检测发现的分子脆弱性维度。因此，将分子读数整合到冷冻保护剂开发和方案优化中，对于推动低温保存迈向不仅要求存活或功能，而且要求忠实保存生物信息的应用至关重要。该研究发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》。