《Microbiology Spectrum》：Diagnostic yield and impact of internal transcribed spacer sequencing from clinical specimens on antifungal management in patients with suspected fungal infection
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内转录间隔区(ITS)测序已越来越多地用于真菌感染诊断。然而，关于其真实世界临床效用的数据有限。研究人员回顾性评估了以最终诊断为金标准时直接临床标本的内转录间隔区(ITS)测序诊断效能，并在一家允许无限制开单的大学医院中研究了ITS测序对抗真菌管理的影响。20
内转录间隔区(ITS)测序已越来越多地用于真菌感染诊断。然而，关于其真实世界临床效用的数据有限。研究人员回顾性评估了以最终诊断为金标准时直接临床标本的内转录间隔区(ITS)测序诊断效能，并在一家允许无限制开单的大学医院中研究了ITS测序对抗真菌管理的影响。2023年11月至2024年4月，共从227例患者中收集315份标本，其中59份(18.7%)来自真菌感染病例。ITS测序灵敏度为35.6%，特异度为96.9%；与真菌培养的一致率为79.7%(κ=0.583)。该环境中阳性结果中位周转时间(turnaround time, TAT)为12(12–14)天。ITS测序仅使2例(0.9%)患者的临床管理发生改变。培养阴性但ITS测序阳性的标本多代表支气管肺泡灌洗液中的定植菌。在无限制开单环境下，ITS测序灵敏度低，对临床决策影响极小；为最大化诊断收益与效用，有必要实施诊断管理(diagnostic stewardship)。
研究背景方面，真菌病发病率与严重程度持续上升，尤其在实体器官移植、造血干细胞移植、血液系统或实体恶性肿瘤、自身免疫病、原发性免疫缺陷、免疫抑制剂治疗及人类免疫缺陷病毒感染等免疫受损人群中威胁显著。传统诊断依赖显微镜检查、常规培养和组织病理学，但显微镜与培养受标本质量、数量和人员经验影响而灵敏度偏低，常规培养还常因生长缓慢导致结果延迟。近十年分子诊断快速发展，内转录间隔区(ITS)位于18S与28S rRNA基因之间的ITS1和ITS2非编码高变区，可用于真菌属种鉴定并检测难培养或生长缓慢病原体。但ITS测序对临床抗真菌管理影响的实际证据不足。Ramathibodi医院允许医师无指征限制开具ITS测序，因此研究人员开展本研究，评价直接临床标本ITS测序诊断效能、与同标本培养结果相关性，以及其改变真菌感染患者治疗的情况。该研究发表于《Microbiology Spectrum》。
关键技术方法上，研究人员在泰国曼谷1300张床位的Ramathibodi医院开展回顾性研究，纳入2023年11月至2024年4月年龄≥18岁、因疑似真菌感染由主治医师申请直接临床标本ITS测序且配有对应真菌培养的非随访成人患者。以主治医师结合临床、微生物学/分子结果及抗真菌治疗反应作出的最终诊断为金标准；ITS测序采用ITS1/ITS4引物扩增ITS1和ITS2，Sanger测序后以BLASTn比对National Center of Biotechnology Information库并报告前5个鉴定结果；统计中用灵敏度、特异度、κ系数和Fisher或χ2检验等分析。
患者特征(RESULTS中Patient characteristics)部分，315份标本来自227例患者，中位年龄61.6(50.1–72.7)岁，44.1%为男性，44.9%免疫受损。ITS测序阳性22例，较阴性组年龄更大、医疗相关感染更多， provisional诊断分布差异显著(P=0.042)；阳性组以侵袭性肺真菌病最常见。ITS阳性组GMS染真菌、真菌培养阳性比例更高，阳性结果TAT为12(12–14)天，阴性结果TAT为2(1,2)天。
ITS测序结果(ITS sequencing results)部分，59份标本来自39例最终真菌感染者，256份来自188例非真菌感染者；ITS测序灵敏度35.6%[21/59]、特异度96.9%[248/256]。在最终真菌感染者中，ITS与培养一致率79.7%(κ=0.583)；培养阴性真菌病例中3/32为ITS阳性，培养阳性真菌病例中9/27为ITS阴性。液体标本126份中15份ITS阳性且均来自体积>1.5 mL者，其中支气管肺泡灌洗液占全部液体阳性；组织标本189份中14份阳性，组织重量≤10 mg与>10 mg间阳性率无显著差异。
对抗真菌管理的影响(Impact on antifungal management)部分，227例中仅2例(0.9%，占真菌感染者5.1%)因ITS结果改变管理：一例为Phaeoacremonium spp.致病变需手术清创而非抗真菌药，另一例脑脓肿检出Chrysocorona lucknowensis后改为两性霉素B联合伏立康唑。7份培养阴但ITS阳标本均未改变治疗，多为定植或污染；支气管肺泡灌洗液ITS阳性多为Candida spp.定植，不启动抗真菌治疗。
讨论(DISCUSSION)部分，研究人员指出无限制开单下ITS测序虽在35.6%确诊真菌病中检出真菌，但直接管理影响仅2例。灵敏度低于文献87.7%–95.6%，因金标准不同；以培养为金标准时灵敏度75.9%。真菌负荷高、标本量足时ITS更可靠。呼吸道标本阳性难区分感染、定植与污染，必须结合临床。Sanger测序限于单菌样本，NGS对混合感染更敏感；本研究TAT长，经验性治疗常已先启动，削弱时效价值。培养阴而ITS阳者少且多为定植，故不推荐支气管肺泡灌洗液常规ITS测序。研究优势为无开单限制下多 provisional诊断大样本且有最终诊断；局限为单中心回顾、非真菌病例多拉低指标、未做28S亚基D1/D2、β-tubulin、EF-1α等靶标、ITS异质性可致直接测序解释困难。
结论部分为：在无限制临床环境中，ITS测序诊断真菌病总体灵敏度低，对抗真菌管理直接影响小，长TAT进一步削弱作用；支气管肺泡灌洗液中因定植比例高而效用有限。为最大化成本效益与临床收益，应实施实验室开单限制并缩短结果TAT。
研究意义在于以真实无限制开单环境证明ITS测序并非“开了就有用”，提示医院需以诊断管理(diagnostic stewardship)约束适应证、优先高真菌负荷/难培养场景、压缩周转时间，并谨慎解释呼吸道标本阳性，从而避免分子检测滥用与误治。
