丁酸钠缓解铜绿假单胞菌感染bMECs：与TLR4/MAPK通路调节及自噬标志物改善相关

《Veterinary Sciences》：Sodium Butyrate Mitigates Pseudomonas aeruginosa Infection in bMECs Associated with the Modulation of TLR4/MAPK Pathway and Improvement of Autophagic Markers

　　

中文摘要

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一种可怕的环境病原体，可引起严重且难治的奶牛乳腺炎。日益加剧的抗菌药物耐药性威胁要求开发新的非抗生素疗法，这些替代疗法应侧重于靶向宿主导向的应答。丁酸钠（Sodium butyrate, SB）是一种重要的短链脂肪酸，具有强大的免疫调节特性。然而，其针对PA诱导的乳腺损伤的保护机制仍不清楚。本研究探讨了SB的功效及其潜在分子机制。bMECs在受到铜绿假单胞菌（1 × 10⁷ CFU/mL，6 h）刺激前，先用0.5 mmol/L SB预处理18 h。研究人员评估了SB减轻PA诱导的牛乳腺上皮细胞（bMECs）细胞毒性的能力。流式细胞术和ELISA证明了SB强大的保护作用。SB预处理显著减少了PA诱导的细胞凋亡，并抑制了促炎细胞因子（包括IL-6和TNF-α）的过度分泌。随后进行了转录组测序（RNA-seq），在PA刺激组和SB处理组之间鉴定出589个差异表达基因（DEGs）。这些DEGs显著富集于Toll样受体（Tlr）、Mapk和自噬信号通路。研究人员随后通过RT-qPCR、Western blotting和免疫荧光进行了分子验证。结果表明，SB显著抑制了TLR4/MAPK级联的过度激活。具体而言，SB显著下调了TLR4的表达，并降低了下游p38、ERK和JNK的磷酸化水平。此外，PA感染诱导了严重的自噬流阻断，这种功能障碍表现为LC3-II和自噬底物p62在细胞内的同步累积。值得注意的是，SB干预与自噬标志物累积的减少相关，这通过促进p62的溶酶体清除得以证实。总之，丁酸钠保护bMECs免受PA诱导的炎症和凋亡，这些保护作用与TLR4/MAPK信号级联的抑制以及自噬标志物累积的缓解密切相关。这凸显了SB作为奶牛乳腺炎临床管理中有前景的预防策略的潜力。

**论文解读：丁酸钠通过调节TLR4/MAPK通路与自噬标志物缓解铜绿假单胞菌诱导的牛乳腺上皮细胞损伤**

**一、研究背景与目的**

奶牛乳腺炎是全球乳业最具经济破坏性的疾病之一，导致动物福利受损、产奶量下降和重大经济损失。在众多致病病原体中，铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*, PA）作为一种难以对付的环境机会致病菌，日益凸显其重要性。PA引起的牛乳腺感染常表现为急性或最急性临床型乳腺炎，且因该病原体对多种抗生素具有内在耐药性并携带多种毒力因子而极难根除。抗菌药物耐药性危机的加剧，迫切要求探索新型的、以宿主为导向的治疗策略，即通过调节局部免疫微环境而非仅仅针对病原体本身。牛乳腺上皮细胞（bMECs）不仅是重要的物理屏障，也是乳腺内先天免疫系统的主要哨兵。PA入侵后，bMECs通过Toll样受体4（TLR4）识别病原体相关分子模式，激活下游如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号网络，引发以TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子大量分泌为特征的炎症反应。此外，新近证据表明PA感染通过诱导凋亡和失调自噬深刻破坏细胞稳态。自噬是高度保守的分解代谢过程，对清除胞内病原体和维持稳态至关重要，但严重的病原体应激可导致自噬功能障碍，表现为自噬体异常累积、炎症信号加剧和细胞损伤加速。然而，PA感染bMECs时TLR4/MAPK炎症轴与自噬流之间的复杂串扰，仍是理解乳腺炎发病机制的关键空白。近年来，短链脂肪酸（SCFAs）作为宿主代谢和免疫反应的有效调节剂备受关注。丁酸钠（SB）作为一种代表性的SCFA和公认的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，在多种胃肠和全身性疾病模型中显示出显著的抗炎、屏障保护和应激缓解特性。尽管如此，SB针对PA诱导的乳腺炎的治疗潜力，特别是其调节TLR4/MAPK信号级联和恢复bMECs自噬流的能力，在很大程度上尚未被探索。因此，本研究旨在阐明PA诱导bMECs炎症、凋亡和自噬改变的精确分子机制，并系统评估SB的保护功效，为SB作为PA相关奶牛乳腺炎临床管理的非抗生素策略提供理论基础。

**二、主要技术方法**

研究人员从三头处于泌乳中期、无临床疾病的中国荷斯坦奶牛（产奶量30.26 ± 3.1 kg/d，胎次2.67，泌乳天数175 ± 6 d）获取乳腺组织，分离纯化原代bMECs并混合为一个样本。所有实验使用第4至第6代细胞。实验分为四组：对照组（Ctrl）、丁酸钠单独处理组（SB）、铜绿假单胞菌感染组（PA）和丁酸钠预处理组（SP）。SP组用0.5 mmol/L SB预处理18 h，再用PAO1标准株（1 × 10⁷ CFU/mL，约MOI 50:1）刺激6 h。通过流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）检测细胞凋亡，ELISA检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平，扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察细胞表面形态与胞内超微结构，RNA-seq（Illumina HiSeq平台，比对到*Bos taurus*参考基因组ARS-UCD1.2）结合GO/KEGG富集分析差异表达基因（DEGs），利用RT-qPCR、Western blotting和免疫荧光对关键基因和蛋白进行分子验证。

**三、研究结果**

**1. 丁酸钠减轻PA诱导的bMECs凋亡与促炎细胞因子过度分泌**

通过流式细胞术检测发现，Ctrl组和SB组细胞凋亡率维持低基线水平（约6%和5%），而PA刺激显著增加了凋亡细胞比例（总凋亡率13.45 ± 1.2%），SB预处理则显著降低了这一比例（降至7.28 ± 0.77%）。ELISA结果显示，PA感染导致IL-6和TNF-α浓度显著升高，而SB干预有效抑制了这种炎症反应，使IL-6从约26 pg/mL降至约16 pg/mL，TNF-α从约310 pg/mL降至约140 pg/mL。这表明SB能减轻PA诱导的细胞凋亡和过度炎症，且自身无细胞毒性。

**2. 转录组分析揭示SB对炎症和自噬通路的调节**

RNA-seq比较PA组与SP组的转录组特征。主成分分析显示两组之间存在显著分离（PC1和PC2分别解释56.60%和13.25%的方差）。以|log2(Fold Change)| > 1且p-adj < 0.05为阈值共鉴定出589个DEGs，其中307个上调、282个下调。KEGG通路富集分析显示这些DEGs显著富集于Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、NOD样受体信号通路和自噬-动物通路。GO富集分析表明DEGs主要参与细胞通讯调节、对刺激反应的调节和细胞过程的负调控等生物学过程。

**3. SB广泛下调PA触发的炎症和自噬相关基因的转录**

RT-qPCR验证结果显示，与Ctrl组相比，PA感染显著上调了免疫受体和促炎介质（*Tlr4*、*Mapk14*、*Il6*、*Il1b*）以及核心自噬相关基因（*Map1lc3b*、*Sqstm1*、*Becn1*、*Atg5*）的mRNA水平。SB处理则全面逆转了这些趋势，显著下调炎症和自噬相关基因的转录，使之趋向正常生理水平。

**4. SB调节PA诱导的自噬蛋白表达与累积**

Western blot检测结果显示，PA刺激诱导LC3-II和Beclin-1显著累积，同时自噬底物p62也大量累积。LC3-II与p62的同步升高表明PA虽启动了自噬体形成，但严重损害了溶酶体降解功能，导致自噬流阻断。SP组中，SB干预显著降低了LC3-II和Beclin-1的蛋白水平，更重要的是促进了p62的清除。TEM观察进一步证实了PA组自噬结构异常和线粒体损伤，而SB处理改善了这些形态学改变，提示SB能改善自噬清除功能。

**5. SB系统性抑制TLR4/MAPK信号级联的过度激活**

免疫荧光染色显示，PA感染诱导bMECs胞质和膜上TLR4（绿色荧光）强烈表达，SB处理后TLR4荧光强度明显减弱。Western blot结果与之一致：PA显著上调TLR4总蛋白表达，并触发p38、ERK和JNK的磷酸化，而SB处理显著抑制了TLR4表达及三种激酶的磷酸化水平，且不影响其总蛋白水平。这表明SB的细胞保护和抗炎功能与抑制TLR4/MAPK信号轴密切相关。

**四、讨论与结论**

本研究系统证明了丁酸钠通过全面抑制TLR4/MAPK炎症级联和减轻自噬标志物累积，有效减轻了PA诱导的bMECs细胞毒性和凋亡。研究结果表明，SB不仅抑制了初始炎症爆发，还关键性地干预并挽救溶酶体降解途径。同时，MAPK与自噬的同步调控提示SB可能通过上游代谢传感器（如AMP活化蛋白激酶AMPK信号轴）协调代谢-免疫串扰。本研究也存在局限性：体外bMEC模型无法完全模拟牛乳房的细胞异质性；未进行TLR4/MAPK信号的药理学或遗传学操作，因此建立的是强关联而非因果证据；RNA-seq分析中缺乏SB单独处理组限制了对SB基线转录组效应的评估；外源SB补充的全身生物利用度需体内验证。

**结论**

综上所述，本研究提供了有力证据表明丁酸钠可减轻PA诱导的细胞凋亡和炎症，这些保护作用与TLR4/MAPK信号级联的抑制及自噬标志物累积的缓解密切相关。这些机制性见解不仅拓宽了对乳腺炎中PA发病机制的理解，也确立了SB作为缓解牛乳腺感染的非抗生素候选药物的潜力。