源自鹌鹑的自然发生的新型传染性法氏囊病病毒重配株

《Veterinary Sciences》：A Naturally Occurring Novel Reassortant Strain of Infectious Bursal Disease Virus from Quails

　　

传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）主要在禽类中引发严重免疫抑制，并已给全球养禽业造成重大经济损失。研究人员从中国江苏省一次疾病暴发中的鹌鹑体内分离到一株新型自然重配IBDV株，命名为IBDV_G3。基因组测序显示，IBDV_G3携带来源于血清2型相关A₀谱系的节段A，而节段B聚集在B_1a经典样谱系内，该基因组组合在未经培养的原始鹌鹑组织中也得到进一步证实。IBDV_G3无需预先适应即可在LMH细胞中高效复制，其VP2可被血清1型VP2特异性单克隆抗体5G10识别。这些发现提示，鹌鹑可能携带重配IBDV株，且鹌鹑-鸡界面值得对IBDV重配和进化变异进行持续监测。

传染性法氏囊病（IBD）是一种由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的急性、高度接触性禽类病毒病，可导致感染禽严重免疫抑制，给全球养禽业造成重大经济损失。IBDV属于双RNA病毒科（Birnaviridae）禽双RNA病毒属（Avibirnavirus），分为血清1型和血清2型，其中血清1型对鸡致病，血清2型对家禽通常不致病。基于双节段基因分型系统，段A可分为A1～A9及A0共10个基因型，段B可分为B1～B5共5个基因型。IBDV宿主谱广，包括鸡、火鸡、鸭、珍珠鸡、鸵鸟和多种野鸟，野鸟可无症状携带病毒，促进病毒的流行病学循环。近年来，基因重配已成为IBDV进化的重要驱动力，多种重配株在全球多地出现。然而，从非鸡宿主中分离到涉及血清2型片段的自然重配株仍极为罕见。为此，研究人员对江苏省一鹌鹑养殖场暴发疫病中采集的患病鹌鹑样本进行了病毒分离与系统鉴定。

研究人员从该养殖场（饲养约60日龄日本鹌鹑约60万只）的12只病鹌鹑脾脏和肝脏样本中，经LMH细胞培养分离到一株病毒，命名为IBDV_G3。通过空斑纯化、透射电镜、间接免疫荧光试验（IFA）、全基因组测序及最大似然法系统发育分析，确认该病毒为IBDV的新型自然重配株：其段A来源于血清2型相关A₀谱系，段B属于B_1a经典样谱系。IBDV_G3无需预先适应即可在LMH细胞中高效复制，感染后72小时病毒滴度达10⁸ TCID₅₀/mL；其VP2蛋白可被血清1型VP2特异性单克隆抗体5G10识别。原始未培养鹌鹑组织中的直接PCR测序结果与培养克隆完全一致，证实该基因组组合真实存在于临床样本中。该研究提示，鹌鹑可能携带重配IBDV，鹌鹑-鸡界面需要持续监测IBDV的重配和进化变异。论文发表于《Veterinary Sciences》。

本研究采用了以下关键技术方法：样本来自江苏省同一鹌鹑养殖场的12只病鹌鹑（约60日龄，发病率5%，死亡率1.5%～2.5%），采集脾脏和肝脏，分别处理。通过LMH细胞培养进行病毒分离并观察细胞病变效应（CPE）；采用空斑纯化获得克隆病毒；透射电镜观察病毒形态；间接免疫荧光试验（IFA）用单抗5G10鉴定VP2蛋白；全基因组扩增后进行Sanger测序；基于最大似然法（ML）构建系统发育树；同时从原始组织匀浆直接扩增段A和段B进行序列验证。此外，排除了常见禽病原如禽腺病毒（FAdV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽流感病毒（AIV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、鸡毒支原体（MG）、滑液支原体（MS）和新城疫病毒（NDV）的混合感染。

结果部分可归纳为以下几个方面。病毒分离与鉴定：12份鹌鹑样本中2份IBDV阳性（阳性率16.67%），组织匀浆接种LMH细胞后出现典型细胞病变效应，包括细胞变圆、脱落和合胞体形成，对照组无病变；空斑纯化后经电镜观察到直径约60 nm的病毒颗粒，符合IBDV形态特征；针对VP5基因的PCR扩增产物与经典株23/82的核苷酸同源性为97.3%，确认为IBDV。病毒形态与免疫学特性：透射电镜显示病毒颗粒直径约60 nm；IFA显示IBDV_G3感染细胞中出现特异性绿色荧光，证实VP2蛋白表达且可与血清1型单抗5G10发生交叉反应。病毒复制动力学：以感染复数（MOI）0.001感染LMH细胞后，病毒滴度在72小时达到10⁸ TCID₅₀/mL，表明该重配株无需适应即可高效复制。基因组特征与系统发育分析：全基因组测序显示，VP2、VP3、VP4、VP5基因与血清2型A0谱系参考株23/82同源性最高（分别为94.9%、94.7%、93.8%、97.3%），而VP1基因与血清1型分离株IBD17JL01同源性最高（97.7%）；系统发育树进一步表明，VP2～VP5聚于A₀（血清2型）亚谱系，VP1聚于B_1a经典样亚谱系。原始组织验证：对原始未培养鹌鹑肝脏匀浆直接进行段A和段B扩增测序，所得序列与培养克隆完全一致，VP2和VP1蛋白同源性分别为99.93%和100%，证实该基因组组合在临床样本中真实存在。

讨论部分指出，以往报道的自然重配IBDV株多限于血清1型内的重配，例如欧洲和中东广泛流行的A3B1重配株、越南的A3B3重配株以及中国的A2dB1新型变异株。IBDV_G3携带血清2型相关A₀段A与B_1a经典样段B，构成一种罕见的跨血清型相关重配株。全球监测显示，基因重配正在重塑IBDV的流行病学格局，例如英国肉鸡群中A3B1重配株曾占81%，近东六国也广泛存在非典型重配基因型。VP2高变区关键突变如D279Y/N、A222V和S254G在多个地区的重配株中被反复