具有强效体内抗类风湿关节炎活性的恶唑封顶4-苯氧基哌啶类CSF1R II型抑制剂的发现

《Bioorganic Chemistry》：Discovery of oxazole-capped 4-phenoxypiperidine CSF1R type II inhibitors with potent in vivo anti-rheumatoid arthritis activity

　　

摘要

集落刺激因子1受体（CSF-1R）是调控巨噬细胞功能和介导炎症反应的关键靶点。阻断CSF-1/CSF-1R信号通路及其下游AKT级联可有效地抑制下游促炎细胞因子的释放，为控制炎症提供了极具前景的治疗策略。基于结构引导的药物设计和系统的构效关系（SAR）优化，我们开发了一系列新型（4-苯氧基）哌啶-1-甲酮衍生物，其中化合物11?g对CSF-1R激酶表现出强效的抑制作用，其IC₅₀值为17.2 nM。此外，化合物11?g在蛋白激酶筛选（1 μM浓度下）中表现出良好的选择性谱。机制研究表明，化合物11?g直接破坏CSF-1/CSF-1R信号传导，导致AKT磷酸化被显著抑制，这在RAW264.7巨噬细胞中p-CSF-1R和p-AKT水平降低中得到了体现。该通路的特异性阻断转化为对促炎细胞因子产生的剂量依赖性抑制，包括TNF-α、IL-6和IL-1β。在体内，化合物11?g展现出可接受的血药动力学特性，并在佐剂诱导性关节炎（AIA）模型中表现出显著的抗类风湿性关节炎效果。这些发现突出了靶向完整的CSF-1R-AKT通路治疗类风湿性关节炎的治疗潜力，并确立了化合物11?g作为进一步开发的前景先导化合物。

引言

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征为进行性的滑膜炎症、软骨退化和不可逆的骨侵蚀[1], [2]。靶向合成改善病情抗风湿药物（DMARDs）的发展显著提高了RA的临床疗效，但约30%的患者仍存在疗效不足或产生耐药性，最终导致关节持续破坏的难治性RA[3]– [5]。目前，RA的发病机制尚未完全阐明[6]，因此继续探索新的治疗靶点和策略具有重要的临床意义。

在RA的发病过程中，滑膜巨噬细胞作为关键效应细胞大量浸润滑膜[7]，并通过分泌肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）等促炎细胞因子[9], [10]，导致滑膜细胞增殖[8]、软骨和骨破坏。近期研究表明，CSF-1/CSF-1R信号轴在协调RA的双重病理过程中发挥着关键作用[11], [12]。CSF1R与其配体CSF-1或IL-34结合后，通过激活包括PI3K/AKT、ERK1/2和STAT3在内的信号通路，促进巨噬细胞的存活、增殖以及向炎症部位的募集[13], [14]。CSF1R信号可将巨噬细胞极化为促炎性M1表型，增强其分泌炎症介质的能力，而其异常激活可能抑制抗炎性M2巨噬细胞的分化，从而破坏炎症与组织修复之间的平衡[15]。在RA小鼠模型中，抑制CSF1R已被证明可减少滑膜巨噬细胞浸润，降低关节液中TNF-α和IL-1β水平，并显著减轻炎症反应[16]。CSF-1R特异性表达于单核细胞谱系的细胞中，包括破骨细胞，在促进破骨细胞分化和增殖方面发挥关键作用[17]。在RA中，炎症性骨侵蚀由过度激活的破骨细胞驱动，这发生在疾病早期。药理学研究表明，在实验性关节炎模型中阻断CSF-1R可消除软骨损伤、骨侵蚀和全身性骨丢失，且该效应与破骨细胞数量减少密切相关[18], [19]。阻断CSF-1R可抑制CSF-1介导的信号传导，减少滑膜巨噬细胞浸润和破骨细胞形成，并抑制炎症因子的产生，从而缓解关节炎症和骨侵蚀。这一机制使CSF-1R成为预防RA关节结构性损害的一个引人注目的治疗靶点[20], [21]。其中，小分子抑制剂具有独特的临床潜力，其优势包括高口服生物利用度、灵活的目标调节以及对滑膜组织的穿透力。

目前，PLX3397和DCC3014已获FDA批准用于治疗腱鞘巨细胞肿瘤[22], [23]。多种在研抑制剂，包括GW2580[24]、BLZ945[25]、JNJ-40346527[26]及其衍生物（图1），靶向CSF-1/CSF-1R信号轴。它们有效地调节巨噬细胞增殖、极化和炎症细胞因子分泌，并在神经炎症、牙周炎和RA的临床前模型中表现出明确的抗炎活性[27]– [29]。然而，这些化合物通常表现出较差的选择性、次优的血药动力学特性或狭窄的治疗窗，限制了临床开发。例如，PLX3397用于RA的I期试验未能启动[30]。JNJ-40346527在II期RA试验后被终止，尽管其显著降低了关节肿胀评分和血清IL-6水平，但未能达到主要疗效终点[31], [32]。另一方面，通过GW2580结构优化获得的JTE-952增强了CSF-1R抑制效力，同时在关节炎动物模型中显示出显著的抗炎和关节保护作用。在甲氨蝶呤难治性佐剂诱导性关节炎大鼠模型中，JTE-952通过抑制关节结构（包括骨和软骨）的损害而显示出疗效，而未减少足部肿胀。这表明CSF-1R抑制的骨保护效应在机制上不同于传统的抗炎疗法[33]– [35]。尽管基于已知抑制剂骨架探索了多种结构修饰，但大多数仍处于临床前开发阶段[36], [37]。JTE-952与CSF-1R的X射线共晶结构（PDB：6IG8）证实了其DFG-out结合模式[37]。与I型抑制剂相比，II型抑制剂具有DFG-out结合口袋，该口袋在激酶家族中保守性较低，导致更高的激酶选择性和更低的脱靶毒性[38], [39]。此外，由于它们与不同的构象状态结合，II型抑制剂通常表现出缓慢的解离动力学，即使在药物洗脱后仍能维持靶点抑制[40]。JTE-952代表了II型CSF-1R抑制策略的范例，显示出高激酶选择性（在测试的187种激酶中仅抑制TrkA）以及在临床前类风湿性关节炎模型中的显著疗效[36], [37]。然而，JTE-952的氮杂环丁烷骨架和GW2580的4-苯氧基吡啶核心仍然是已知II型CSF-1R抑制剂的主要结构框架。开发具有化学差异结构的CSF-1R抑制剂仍是扩展II型抑制剂结构多样性并实现差异化药理学特性的一个重要方向。

在本研究中，我们报道了一种基于结构设计的新型CSF-1R抑制剂。通过互补优势片段，我们构建了一种以苯氧基为核心的新型分子骨架。通过系统的结构优化，鉴定了化合物11?g。它是一种新型CSF-1R激酶抑制剂，采用独特的羰基-氧铰链结合模式，在体外显示出高活性和选择性。该化合物有效抑制炎症因子的释放，并在类风湿性关节炎（RA）动物模型中表现出良好的体内治疗活性。

章节片段

设计策略

化合物13是一种强效II型c-KIT抑制剂，同时也对PDGFRβ、DDR1和CSF-1R激酶表现出强效抑制活性[41]。为开发新型CSF-1R抑制剂，我们将化合物13对接到CSF-1R激酶结构域DFG-out构象的晶体结构中（PDB ID: 3LCO），以阐明其结合模式（图2A）。发现连接吡啶和哌啶基团的酰胺羰基与铰链残基Cys 666形成氢键，而末端酰胺基团

结论

总之，通过结构引导的片段互补和系统SAR优化，我们鉴定了一种新型II型CSF-1R抑制剂——化合物11?g，其具有带有噁唑环的4-苯氧基哌啶骨架。化合物11?g具有独特的噁唑封端的4-苯氧基哌啶骨架。其羰基-氧铰链结合模式赋予独特的结合几何结构，从而赋予其优异的选择性。对三个可变区域的系统优化揭示了明确的SAR，

化学方法

所有溶剂和试剂均购自正规厂家，严格按照使用说明使用或按文献描述制备。用于表征¹H和¹³C的仪器为Bruker 500 MHz NMR波谱仪。参考溶剂为重代二甲基亚砜（DMSO?d₆），ppm（δ）表示化学位移。部分¹H NMR谱在400 MHz波谱仪上测定，以氯仿?d₆为溶剂，在室温下进行。在

统计分析

统计分析使用SPSS 20.0软件进行，图形使用GraphPad Prism 10.0软件生成。组间比较采用非参数Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析（ANOVA），随后进行适当的事后检验：Tukey's或Tamhane's T2。所有数据以均值±标准误（SEM）表示，显著性水平P < 0.05被认为是具有统计学意义。

CRediT作者贡献声明

夏真尼：撰写——初稿，形式分析。周学健：形式分析，数据管理。郭照辉：方法学。冯红燕：方法学。易琴丽：方法学。张梦茹：方法学。任梦君：方法学。谢天：方法学。陈照霖：验证，方法学，数据管理。史敬博：软件，数据管理，构思。刘学松：撰写——初稿，监督，资金获取。

未引用参考文献

[4], [28], [34]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文所报告的工作。

致谢

安徽省高等学校科研项目（2023AH050567），安徽医科大学药学院高水平学科人才基金（2023xkjd16），安徽省高校青年优秀人才基金（NO:2023AH030114），安徽省重点研发项目（NO:202204295107020023）。

Zhenni Xia|Xuejian Zhou|Zhaohui Guo|Hongyan Feng|Qinli Yi|Mengru Zhang|MengJun Ren|Tian Xie|Zhaolin Chen|Jingbo Shi|Xuesong Liu

安徽省炎症与免疫介导疾病重点实验室，安徽医科大学药学院，合肥230032，安徽省，中华人民共和国