整合过程：上游条件对温和破碎酵母细胞壁性质与胞内蛋白释放的影响

《Bioresource Technology》：Integrating processes: Impact of upstream conditions on cell wall properties and intracellular protein release from mildly disrupted yeast

　　

精准发酵为可持续生产高品质蛋白质提供了一种有前景的途径，这些蛋白质可用于开发无动物源蛋制品和乳制品，或通过增强植物基产品的功能和营养特性来补充植物蛋白。酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）因其一般公认安全（GRAS）地位、翻译后修饰能力以及全面的基因工程工具而成为合适的生产宿主。重组蛋白的分泌通常更受青睐，因为它简化了下游加工（DSP）；然而，包括血红蛋白和酪蛋白在内的若干工业相关蛋白仍难以高效分泌，因此胞内生产提供了一种有前景的替代方案。目前，高效且经济可行的胞内蛋白回收仍是重组发酵过程中的重大挑战。在胞内生产过程中，细胞被膜高度相关，因为它分隔了胞内与胞外环境，并限制了对目标蛋白的获取。对于酿酒酵母而言，细胞被膜由磷脂膜及其外层的刚性且动态的细胞壁组成，后者由几丁质、β-葡聚糖和甘露糖蛋白的复杂网络构成。细胞壁除提供结构强度和环境胁迫保护外，还限制了大分子跨细胞边界的运输。因此，细胞破碎是释放目标蛋白所必需的，这对胞内蛋白回收构成了重大挑战。传统的机械破碎方法需要高能量输入，而酶法处理依赖于昂贵的酶混合物。此外，完全细胞破碎会释放大量宿主细胞杂质，从而增加下游加工复杂性和纯化成本。因此，替代性温和破碎策略因其更具选择性地释放胞内蛋白的能力而受到越来越多的关注。这些替代性温和破碎技术，包括化学透化处理和脉冲电场（PEF）处理，依赖于透化细胞膜而细胞壁基本保持完整。在此条件下，胞内蛋白的释放强烈依赖于其穿过细胞壁网络的能力。因此，细胞壁孔隙率成为控制胞内蛋白释放的关键因素。已有研究表明，酿酒酵母的细胞壁孔隙率可基于大分子的选择性渗透性及其跨细胞壁运输动力学来评估。孔隙率主要受甘露糖蛋白外层结构组织和交联程度的控制，并对培养条件高度敏感。疏水性低共熔溶剂（HDES）最近被提出作为微生物细胞的新型膜透化剂。HDES由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）组成，以特定摩尔比混合时可形成熔点降低的液体。研究表明，HDES能有效透化微生物细胞膜，同时可能仅造成有限的细胞壁破坏。这一特性使HDES特别适合作为研究培养依赖性细胞壁组织变化与胞内蛋白释放之间关联的工具。迄今为止，培养诱导的细胞壁重组与温和破碎酿酒酵母胞内蛋白释放之间的关系在很大程度上仍未得到探索。因此，本研究考察了培养条件如何影响酿酒酵母的细胞壁稳健性和胞内蛋白释放。使用一株胞内积累荧光蛋白ymNeonGreen的重组酿酒酵母菌株作为报告系统，以确认胞内蛋白的释放。首先进行了摇瓶筛选，评估培养pH和葡萄糖限制的影响；随后采用工业相关的受控生物反应器分批补料和分批补料培养，进一步研究生长阶段和培养模式的影响。通过酵母裂解酶敏感性测定以及HDES辅助细胞膜透化后监测胞内蛋白释放，间接评估了细胞壁性质尤其是稳健性和蛋白渗透性的差异。通过将培养条件与下游加工效率联系起来，这项工作强调了使上游和下游开发保持一致对于通过温和破碎实现最佳胞内蛋白回收的重要性。

**论文解读：上游培养条件调控酿酒酵母细胞壁特性与温和破碎下胞内蛋白释放的整合研究**

**一、研究背景与问题提出**

精准发酵被视为可持续生产高品质蛋白质的重要途径，尤其可用于开发替代蛋白食品。酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）凭借其GRAS（generally recognized as safe，一般公认安全）地位、翻译后修饰能力和成熟的基因工程工具，成为理想的蛋白生产宿主。尽管分泌型重组蛋白的表达更利于下游加工，但血红蛋白、酪蛋白等许多工业相关蛋白难以高效分泌，因此胞内生产成为重要替代方案。然而，胞内蛋白回收效率低下一直是制约该工艺经济性的关键瓶颈。

细胞被膜在胞内生产过程中扮演核心角色，它分隔胞内外环境并限制大分子运输。酿酒酵母细胞壁由几丁质、β-葡聚糖和甘露糖蛋白构成的复杂网络组成，不仅赋予细胞结构强度和环境胁迫抗性，同时也阻碍大分子跨壁运输。因此，释放胞内蛋白必须进行细胞破碎。传统机械破碎能耗高，酶法处理依赖昂贵酶制剂，且完全破碎会释放大量宿主细胞杂质，增加纯化成本。温和破碎技术如化学透化和脉冲电场（PEF）处理，通过透化细胞膜而尽量保持细胞壁完整，此时蛋白释放强烈依赖于其穿越细胞壁的能力，因而细胞壁孔隙率成为关键限速因素。

已有研究指出，细胞壁孔隙率主要受甘露糖蛋白外层结构组织和交联程度控制，且对培养条件高度敏感。疏水性低共熔溶剂（HDES）作为新型膜透化剂，可有效透化微生物细胞膜而仅造成有限细胞壁损伤，为研究细胞壁组织与蛋白释放的关系提供了理想工具。然而，培养条件诱导的细胞壁重组与温和破碎下胞内蛋白释放之间的关联此前鲜有系统研究。

**二、研究目的与主要研究内容**

本研究旨在探究培养条件如何影响酿酒酵母细胞壁稳健性和胞内蛋白释放。研究人员使用一株胞内积累荧光蛋白ymNeonGreen和mRuby2的重组酿酒酵母菌株ScNti001（衍生自CEN.PK113-7D，分别由TEF1和HSP12启动子控制表达）作为报告体系。首先通过摇瓶筛选考察培养pH（3.0与6.0）和葡萄糖条件（充足与限制）的影响；随后在受控生物反应器中进行分批补料和不同补料速率的补料分批培养，研究生长阶段和培养模式的作用。通过酵母裂解酶敏感性测定（zymolyase susceptibility assay）间接评估细胞壁稳健性，通过HDES辅助膜透化后监测可溶性蛋白释放评估细胞壁蛋白渗透性，并将结果与生理状态参数关联分析。

**三、关键技术方法**

本研究采用的主要技术方法包括：摇瓶和生物反应器培养系统进行不同培养条件筛选；HDES（由DL-薄荷醇与癸酸按摩尔比1:1合成）辅助细胞膜透化处理；流式细胞术测定细胞活性（PI染色）和胞内荧光蛋白含量；酵母裂解酶敏感性测定计算最大裂解速率（MLR，maximum lysis rate）；Bradford法测定可溶性蛋白含量；ymNeonGreen荧光检测确认蛋白胞内来源；尺寸排阻色谱（SEC）分析释放蛋白表观分子量分布；酸水解结合高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）定量甘露糖以间接评估甘露糖蛋白释放；总氮测定及生长速率计算（分批培养基于CO?产生速率，补料分批培养基于在线OD数据）。所有条件均使用两个独立生物学重复，每个重复进行两次独立破碎处理或三次酵母裂解酶实验。

**四、研究结果**

**3.1 摇瓶筛选：生长条件强烈影响细胞壁组织**

在pH 3和pH 6下分别进行葡萄糖充足和葡萄糖限制培养。结果显示，葡萄糖充足培养的细胞在膜透化后蛋白释放量始终高于葡萄糖限制培养，表明其细胞壁表观渗透性更高；pH 6培养细胞比pH 3培养细胞释放更多可溶性蛋白。HDES处理4小时后，最高蛋白释放量来自pH 6葡萄糖充足培养（38.0±0.4 mg/g_CDW），最低来自pH 3葡萄糖限制培养（5.4±0.2 mg/g_CDW）。葡萄糖充足条件下蛋白释放量比葡萄糖限制条件高3.8倍，pH 6比pH 3约高1.9倍。酵母裂解酶敏感性方面，葡萄糖充足培养的MLR显著高于葡萄糖限制培养（约5倍），但pH影响不显著。这些结果表明葡萄糖可用性是比pH更强的决定因素。值得注意的是，酵母裂解酶敏感性与蛋白渗透并非在所有条件下完全一致，提示两者反映的是相关但不同的细胞壁特性（β-葡聚糖交联可及性与甘露糖蛋白网络孔隙性）。

**3.2 生物反应器培养：不同培养条件产生生理状态各异的生物量**

研究人员开展了四种生物反应器培养：分批指数期收获（batch_exponential）、分批稳定期早期收获（batch_stationary）、高速率补料分批（高速率，μ_set=0.15 h^-1）和低速率补料分批（低速率，μ_set=0.03 h^-1）。酵母裂解酶敏感性差异显著：分批指数期生物量具有最高MLR（0.037±0.000 min^-1），低速率补料分批最低（0.002±0.000 min^-1）。分批指数期MLR分别比高速率和低速率补料分批高3.4倍和19.4倍；高速率补料分批比低速率高5.7倍。稳定期细胞MLR比指数期低1.7倍，反映细胞壁在饥饿适应中强化。生理状态方面，实际比生长速率分别为：分批指数期0.40 h^-1、分批稳定期（收获前五小时平均）0.13 h^-1、高速率补料分批0.07 h^-1、低速率补料分批0.02 h^-1。氮含量从分批指数期的10.0%递减至低速率补料分批的6.6%。胞内可溶性蛋白含量在分批培养中较高；ymNeonGreen水平与生长速率正相关，而胁迫响应启动子HSP12控制的mRuby2在低速率补料分批中最高。

**3.3 培养依赖性生理状态影响胞内蛋白渗透行为**

HDES处理一小时内所有细胞膜均被透化。可溶性蛋白释放量最高来自分批指数期生物量（16.0±0.8 mg/g_CDW），依次为高速率补料分批（10.5±1.5 mg/g_CDW）、分批稳定期（6.1±0.6 mg/g_CDW）和低速率补料分批（2.8±0.5 mg/g_CDW）。分批指数期相比低速率补料分批蛋白释放提高了5.7倍。ymNeonGreen荧光随时间增加证实蛋白来源于胞内，阴性对照无释放则确认释放依赖HDES透化。相关性分析表明，生长速率与酵母裂解酶敏感性可用探索性双曲线模型描述（R²=0.9863，ΔAICc=-26.44），蛋白释放与生长速率（Pearson r=0.8514，p=0.007）和酵母裂解酶敏感性（Pearson r=0.8143，p=0.01）均呈线性正相关。但稳定期与高速率补料分批之间的不一致提示甘露糖蛋白与β-葡聚糖组织对酵母裂解酶敏感性和细胞壁渗透性的差异化影响。

**3.4 细胞膜透化优先释放小尺寸胞内组分**

对分批指数期生物量经膜透化和珠磨（BB）完全破碎的上清液进行分析。膜透化上清液中的甘露糖含量比完全破碎上清液低3.9倍，表明膜透化导致的甘露糖蛋白释放较少。表观分子量分析显示，膜透化细胞上清液中<5 kDa组分最丰富（45±2%），而完全破碎细胞上清液中>100 kDa组分占最大比例（71±2%）。膜透化上清液中5–40 kDa和40–100 kDa的相对比例分别为27±1%和28±2%。该结果与文献中PEF处理后优先释放<3 kDa肽段的报道一致，表明温和透化可选择性释放较小尺寸的胞内组分（如肽段和氨基酸）。

**五、总结与讨论**

讨论部分指出，目前温和破碎技术受限于缓慢且有限的蛋白释放，例如PEF处理酿酒酵母需16–24小时才达到最大蛋白产量，微藻体系产量也较低。本研究表明培养条件极大影响温和破碎下蛋白释放效率，因此未来研究应将培养条件与下游工艺协同优化。此外，研究揭示了两种新策略：一是可在蛋白生产阶段与细胞破碎之间引入细胞壁重塑阶段，以同时优化目标蛋白产量和细胞壁渗透性；二是利用HDES膜透化作为生物质预处理步骤，优先释放小分子杂质（肽、氨基酸、核苷酸和碳水化合物），使细胞壁充当第一道生物过滤器，随后再进行完全破碎以释放目标蛋白（如血红蛋白），从而简化下游纯化。

**六、研究结论**

本研究证明培养条件与膜透化酿酒酵母生物量的细胞壁特性和蛋白渗透行为相关。摇瓶培养显示，pH 6比pH 3培养蛋白释放增加1.9倍；葡萄糖充足细胞比葡萄糖限制细胞蛋白释放高3.8倍。在受控生物反应器规模中，分批指数期收获的生物量比低速率补料分批培养生物量具有19.4倍更高的酵母裂解酶敏感性和5.7倍更高的可溶性蛋白释放。此外，高速率补料分批比稳定期生物量释放更多蛋白，可能反映以较高速率向稳定期细胞添加营养物可导致细胞壁修饰从而增强蛋白渗透性。最后，表观分子量表征表明膜透化后释放的物质富含小于100 kDa的分子，提示优先释放较小尺寸组分。综上，生理状态、酵母裂解酶敏感性与蛋白渗透行为之间的相关性凸显了在开发胞内蛋白生产工艺时整合上游与下游加工的重要性。这一新方法有望提高温和破碎技术的整体蛋白产率和加工效率，促进其工业规模应用。该论文发表于《Bioresource Technology》。