SARS-CoV-2 Delta变异株在Vero E6细胞中的实验室适应增强体外增殖但削弱人TMPRSS2依赖的适合度、致病性与传播力

《Biosafety and Health》：Laboratory adaptation of the SARS-CoV-2 Delta variant in Vero E6 cells enhances in vitro growth but attenuates human TMPRSS2-dependent fitness, pathogenicity, and transmission

　　

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的实验室扩增对病毒学研究至关重要，但在低人跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）表达的非人细胞中传代可能改变与生物安全和风险评估相关的表型。研究人员旨在明确非洲绿猴来源Vero E6细胞中连续传代如何影响临床Delta毒株的增殖、进入途径、致病性和传播能力。亲本病毒经连续传代产生两种适应变异株，并通过全基因组测序、复制与竞争实验、刺突（spike）蛋白切割及膜融合分析、受体结合研究和动物实验进行表征。第一种变异株获得spike置换P217S、S247R和H655Y，第二种获得G261R以及弗林（furin）切割位点上游6个氨基酸缺失，并伴非spike突变。两株在Vero E6、LLC-MK2、表达人血管紧张素转换酶2（ACE2）的Huh-7和HeLa细胞中均比亲本更高效复制，但在Caco-2细胞中不然。其表型反映对人TMPRSS2利用的改变而非人ACE2结合改变；对非洲绿猴ACE2亲和力升高，对人受体亲和力不变。尽管体外增殖增强，两株在动物中致病性与传播均降低。这些发现表明Vero E6传代可快速重塑spike功能，筛选出体外生长改善但体内蛋白酶依赖适合度受损的病毒，支持在使用的实验室扩增毒种前进行严格基因组与表型监测。

研究背景方面，SARS-CoV-2关切变异株持续出现，Delta（B.1.617.2）以更高传播力和致病性著称。其spike糖蛋白突变可增强受体结合、改变抗原性并影响宿主进入因子利用，其中TMPRSS2可切割spike促进进入，与呼吸道高效复制、合体形成和重症相关。Vero E6细胞源于非洲绿猴肾、干扰素产生缺陷，是SARS-CoV-2实验室扩增常用基质；但非人、低人TMPRSS2系统中适应如何重塑spike功能、宿主因子利用及动物宿主机理仍不清楚。研究人员因此将临床Delta分离株在Vero E6中连续传代，分离两种细胞适应变异株，系统比较其与亲本在复制动力学、竞争适合度、受体结合、膜融合、spike切割、动物致病与传播中的差异，以明确体外增殖增强与体内适合度下降是否由人TMPRSS2（hTMPRSS2）利用改变驱动。该研究发表于《Biosafety and Health》，对毒种质控和生物安全评估有直接意义。

主要关键技术方法上，研究人员使用临床Delta CS毒株及传代后斑块纯化获得的Delta CAS1、CAS2变异株；以Vero E6、Vero E6^hTMPRSS2+、LLC-MK2、Caco-2、Huh-7、HeLa^hACE2+等细胞系做复制与竞争适合度分析；用表面等离子共振（SPR）测人、非洲绿猴、恒河猴ACE2结合；用分裂荧光素酶报告系统做细胞-细胞融合与spike介导合体分析；用假病毒进入实验加camostat甲磺酸盐抑制hTMPRSS2评价进入途径；动物端采用H11-K18-hACE2转基因小鼠评估体重、生存、喉拭子与肺/鼻甲病毒载量及肺病理，用叙利亚仓鼠供体-接受体单向气流接触模型评估气溶胶传播。

3.1. Genetic characterization of Vero E6-adapted Delta variants：研究人员对P6至P9 spike区测序发现混合亚群，斑块纯化得CAS1与CAS2；全基因组测序显示CAS1含P217S、S247R、H655Y，CAS2含G261R与QTQTNS^675-680del及NSP9、NSP14非spike突变，传代后特征突变稳定。

3.2. Replication of cell-adapted Delta variants in multiple cell lines：研究人员测多细胞系滴度与RNA载量，发现两适应株在Vero E6、Vero E6^hTMPRSS2+、LLC-MK2、Huh-7、HeLa^hACE2+增殖更快更高，在Caco-2中反之；hTMPRSS2高表达条件下亲本增益更大，说明适应株对人TMPRSS2利用下降。

3.3. Competitive fitness of cell-adapted Delta variants：研究人员做两两竞争实验，CAS1、CAS2在除Caco-2外多数细胞系优于亲本，CAS1在人细胞系优于CAS2，适合度优势具细胞类型依赖性。

3.4. Binding affinity of cell-adapted Delta spike proteins to ACE2 from multiple species：研究人员用SPR发现两适应株对非洲绿猴ACE2亲和力升高，对恒河猴与人ACE2结合无明显变化，提示适应指向传代细胞宿主ACE2。

3.5. Cell-adapted Delta variants show reduced spike cleavage, fusion, and hTMPRSS2 responsiveness：研究人员通过假病毒、过表达hTMPRSS2、camostat抑制、真病毒免疫印迹与斑块试验，发现CAS1/CAS2的spike切割效率、膜融合、hTMPRSS2响应均降低；H655Y、G261R、QTQTNS^675-680del是减弱hTMPRSS2利用关键，P217S、S247R、QTQTNS^675-680del增强HeLa^hACE2+假病毒感染性。

3.6. Cell-adapted Delta variants show altered pathogenicity in mice and reduced transmission in hamsters：研究人员在H11-K18-hACE2小鼠中见CAS2死亡延迟、肺与鼻甲载量更低、肺泡壁增厚和炎症浸润轻于亲本；仓鼠气溶胶传播中Delta CS 2天传遍5只，CAS1延迟至5天传遍，CAS2仅2/5感染，适应株体内适合度削弱。

讨论部分中，研究人员指出Vero E6连续传代产生体外增殖增强但体内相关适合度下降的变异株，复制优势非普遍而是细胞类型依赖；机制上适应株对非洲绿猴ACE2亲和力升、对人ACE2不变，spike切割与融合减弱、hTMPRSS2依赖降低，可能转向内吞进入但并非直接验证。CAS1中P217S/S247R补偿H655Y衰减故小鼠致死未明显减轻，CAS2中弗林位点上游缺失叠加G261R致更明显减毒。研究提示非人细胞传代适应可跨变异株发生，毒种若用于疫苗、抗病毒与公卫风险评估，仅测序不够，需宿主相关表型验证；局限是无反向遗传学活病毒、单一MOI传代条件、内吞转向未直接证实。

结论翻译：Vero E6细胞中的实验室适应可快速重塑Delta spike功能，选出体外生长更好但hTMPRSS2依赖体内适合度、致病性与传播力减弱的病毒；适应主要体现为对传代宿主ACE2亲和力改变及hTMPRSS2利用下降，而非人ACE2结合改变。研究支持对实验室扩增SARS-CoV-2毒种开展基因组与表型双重监测，以避免细胞培养适应误导风险研判与干预评估。