计算辅助半理性工程改造线叶烟草α-葡聚糖磷酸化酶以增强纤维二糖至直链淀粉的级联合成

《Bioresource Technology》：Computationally assisted semirational engineering of Nicotiana attenuata α-glucan phosphorylase enhances cellobiose-to-amylose cascade synthesis

　　

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  通过计算工程构建了一个包含37个NicαGP突变体的文库。
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  L226Y/V437L/F751H的活性是野生型NicαGP的2.10倍。
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  三重突变体改善了热稳定性和动力学性能。
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  在纤维二糖/G4比为1:2时，级联产量提高了26.5%。
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  结构分析将活性提升与调控层的优化联系起来。

引言

直链淀粉是一种线性的α-1,4-葡聚糖，其链构象、结晶行为和组装特性支持食品、材料以及生物基应用。在食品体系中，高直链淀粉含量的淀粉与较慢的消化速率以及更高的抗性淀粉形成倾向相关(Bojarczuk等，2022)。在材料科学领域，直链淀粉成膜、包埋活性化合物以及形成螺旋包合物的能力，支持了其在可生物降解包装、活性化合物递送系统、功能涂层以及多糖基材料等方面的应用(Zhong和Nidetzky，2024)。天然直链淀粉嵌埋在富含支链淀粉的淀粉颗粒中，使得其回收在技术上颇具难度，并限制了对分子量分布和支链的控制。酶促合成可以绕过这一分离负担，同时直接控制糖苷键类型、链长和分子组装(Zhong和Nidetzky，2024；Cifuente等，2024；Pylkk?nen等，2024；De Doncker等，2024)。在现有策略中，纤维二糖磷酸化酶（CBP）与α-葡聚糖磷酸化酶（αGP）的双酶级联，提供了一条从非食用纤维素糖类到直链淀粉的简洁路径。纤维二糖是纤维素酶解过程中产生的主要可溶性二糖，因此为上段木质纤维素解构与下段葡聚糖生物合成之间提供了一个明确的界面(Wang等，2026；Xu等，2023)。本研究因此聚焦于明确的纤维二糖到直链淀粉下段模块，利用纤维二糖作为上段木质纤维素解构与下段葡聚糖生物合成之间的界面。在该体系中，CBP磷酸解纤维二糖生成葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖。αGP随后以G-1-P作为糖基供体、以麦芽寡糖作为引物，延伸α-1,4-葡聚糖链(Ohdan等，2007；Gao等，2025)。先前的研究表明，CBP–αGP级联可通过控制引物可用性，实现分子量（Mw）和结构特性可调的直链淀粉合成(Gao等，2025；Gao等，2026)。因此，提高CBP–αGP级联的效率和稳健性，对于将非食用碳水化合物资源升级为可编程直链淀粉材料至关重要(Xu等，2023；Wang等，2026)。

在CBP–αGP级联中，αGP控制G-1-P的消耗、引物延伸和直链淀粉的形成(Ohdan等，2007)。先前的工作已确立花烟草α-葡聚糖磷酸化酶（NicαGP，NCBI RefSeq: XP_019260179.1）为一个高性能骨架，其对麦芽四糖（G4）的比活为82.1 U/mg，k_cat/K_m为27.46 mM^?1 s^?1。当与热纤 cellulose 梭菌纤维二糖磷酸化酶（CtCBP，GenBank: AAL67138.1）联用时，NicαGP可实现从纤维二糖合成直链淀粉，最大转化率为28.4%，产品Mw可调范围为6602至67,154 g/mol(Gao等，2025)。随后的工艺优化将CtCBP–NicαGP级联的最大转化率提高至35.84%，并证明了引物可用性主导Mw编程、晶体多态、形貌和热行为(Gao等，2026)。这些发现确立了NicαGP作为高性能骨架的地位，使得在不破坏保守催化结构的前提下进行进一步提升成为核心工程挑战。由于级联输出还受到G-1-P通量、葡萄糖积累、无机磷酸（Pi）回收、引物可用性和可逆性的限制，酶层面的提升预计不会线性转化为最终转化率。先前的研究同样强调了中间体通量的平衡和G-1-P的高效利用(Gao等，2026；Sigg等，2024；Liu等，2022)。因此，提高G-1-P/引物的利用效率并缩短达到峰值转化的时间，仍是核心工程目标。

对于NicαGP的工程改造，随机突变或全局饱和突变可能不是最高效的策略。αGP是一种吡哆醛磷酸（PLP）依赖型酶，结合多种底物，其催化需要G-1-P、PLP和麦芽寡糖引物在空间上的精确组织。先前的NicαGP分析显示，Gly196、Arg706、Lys711和Lys821与PLP和底物的定位密切相关，丙氨酸扫描也证实了这些残基在定位催化机器中的关键作用(Gao等，2025)。因此，计算辅助的半理性工程提供了一种比广泛的随机或饱和突变更有针对性的替代方案。AlphaFold3提供结构背景；ProteinMPNN提出与骨架兼容的替换；EVcouplings提供进化约束；结构注释优先关注配体相关、口袋相关和通道相关的位点；DynaMut2过滤稳定性风险。这些互补的来源共同缩小了实验搜索空间，同时保留了由结构、序列、进化或稳定性信息支持的替换（Abramson等，2024；Braun等，2023；Dauparas等，2022；Guo等，2025；Hopf等，2019；Rodrigues等，2021；Yang等，2024；Zhou等，2024）。类似的集成策略已改善了食品与工业生物技术相关酶的活性、稳定性和应用性能，包括α-1,3-岩藻糖基转移酶、过氧化氢酶、D-阿洛酮糖3-表异构酶和几丁质酶(Guo等，2025；Li等，2025；Xu等，2025；Qi等，2023；Zhou等，2025)。然而，仅靠计算优先排序无法确定最佳的多位点基因型，因为突变效应依赖于背景。酶进化和蛋白质功能设计的研究表明，上位效应普遍存在，可能源于分子内网络重接或限速步骤的转移，并且必须在组合工程中被明确考虑(Buda等，2023；Lipsh-Sokolik和Fleishman，2024；Judge等，2024；Fr?hlich等，2024)。因此，对于NicαGP，设计策略应在保留Gly196/Arg706/Lys711/Lys821网络的同时，检验周围调控区域的合作效应。

据此，我们假设保守催化核心周围的第一层、第二层、口袋和通道残基可以被工程改造，以改善底物可及性、局部堆积、预组织和催化口袋几何，而不直接扰动催化核心。AlphaFold3、ProteinMPNN、EVcouplings、结构先验信息和DynaMut2被集成用于突变设计，随后进行单点突变和组合筛选。最优变体随后进行了酶学特性、动力学、级联性能、对接、通道架构和分子动力学的评估。本研究因此检验了一种保留催化核心的工程策略，以改进NicαGP并验证在纤维二糖到直链淀粉合成中的组合协同效应。

章节摘要

材料与试剂

酵母浸粉、胰蛋白胨、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和氨苄青霉素购自上海 Sangon Biotech。D-葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）购自上海 Aladdin Scientific。二喹啉甲酸（BCA）蛋白质测定试剂盒购自南京 Vazyme Biotechnology。可溶性淀粉、麦芽糖（G2）、麦芽三糖（G3）、麦芽四糖（G4）、麦芽五糖（G5）、麦芽六糖（G6）、无水乙醇、钼酸铵、醋酸锌，

计算辅助设计为NicαGP定义了一个实验可行的突变空间

图1所示的工作流确立了一条从计算优先排序到实验验证的路径，并可进行结构解读。集成的计算工作流生成了916个候选替换，其中763个来自ProteinMPNN，113个来自EVcouplings，38个同时得到ProteinMPNN和结构先验信息的支持，2个同时得到EVcouplings和结构先验信息的支持。这些候选者是经过计算优先排序的，而非经过实验验证或被假定为

结论

本研究确立了一种计算辅助的半理性工程策略，用于在保留NicαGP保守催化架构的同时对其进行改进。结构、进化和稳定性信息的整合将916个计算候选者缩减至37个实验验证的变体，组合筛选确定L226Y/V437L/F751H为最优突变体。该三重突变体达到了210.16 ± 1.26%的相对活性（为同批次野生型的2.10倍），并表现出正上位效应

CRediT作者贡献声明

Wei Gao（高伟）： 撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，软件，方法论，调查研究，形式分析，数据整理，概念构思。Mengli Li（李梦丽）： 撰写——审阅与编辑。Ming Miao（苗明）： 资源。Tao Zhang（张涛）： 撰写——审阅与编辑，资源，项目管理，资金获取，数据整理。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到国家重点研发计划（2022YFC3401703）的资助。

高伟|李梦丽|苗明|张涛