通过辅因子中性代谢重编程实现高效甲醇生物转化，闭合二氧化碳至乙醇酸的转化回路

《Bioresource Technology》：Closing the CO 2-to-glycolic acid loop through efficient methanol bioconversion enabled by cofactor-neutral metabolic rewiring

　　

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  对K. phaffii的代谢重编程使其能够以甲醇为底物生产乙醇酸。
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  辅因子中性设计缓解了甲醇同化过程中的氧化还原约束
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  以甲醇为唯一碳源时，乙醇酸滴度达到41.2 g/L。
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  在纯甲醇生物转化中实现了0.41 g/g的创纪录得率。

引言

世界正快速逼近关键的生态临界点，CO₂浓度升高威胁着主要冰盖的不可逆崩塌和灾难性的生物多样性丧失（Glikson, 2018, Hughes et al., 2003）。与此同时，难降解塑料的持续积累及其碎解为有毒微塑料，已引发了一场次生全球生态与健康危机（Geyer et al., 2017）。应对这些交织在一起的紧急问题，需要一种根本性的协同范式。因此，将CO₂直接转化为可生物降解塑料单体，为生产可持续聚合物提供了一条变革性路径，从而实现用环保替代品取代各类传统石化塑料。这一集成策略将材料制造与化石原料脱钩，有助于碳减排并降低持久性塑料废弃物带来的环境负担。

要实现这一目标，将CO₂高效转化为高附加值产品需要同时实现碳还原和选择性碳链构建。化学催化尤其适合克服CO₂的高活化能垒，并将其转化为甲醇和甲酸等能量丰富的C₁中间体（Jiang et al., 2020）。然而，随后通过化学催化将这些C₁中间体升级为功能化多碳产物往往选择性不佳（Nitopi et al., 2019）。相比之下，C₁生物转化通过精确的酶催化实现高度选择性的碳链延伸，同时避免了直接生物固CO₂固有的低效率问题，具有互补优势（Liu et al., 2020）。

在CO₂衍生的碳载体中，甲醇已成为可持续C₁生物制造最具吸引力的底物之一。作为液态底物，甲醇完全溶于水，有利于高效传质，且比气态底物更易于运输和储存（Al-Rowaili et al., 2018）。此外，甲醇具有高度还原性，每个碳原子提供的还原力比葡萄糖高出50%，从而为还原性化学品的生物合成提供了巨大优势（Antoniewicz, 2019, Zhang et al., 2017）。预计CO₂衍生的甲醇价格到2050年将降至每吨250美元（IRENA and Methanol Institute, 2021）。因此，大量研究致力于改造甲基营养微生物，以甲醇为底物合成燃料、化学品和材料（Guo et al., 2023）。为克服甲醇过度氧化供能导致的本征低碳转化效率问题，已广泛探索了多种策略，主要包括通过重编程异化代谢减少碳损失以及工程化胞内辅因子平衡（Cai et al., 2022, Wu et al., 2023）。尽管取得上述进展，但在高通量生产条件下，传统策略往往仍不够充分，因为高效的甲醇生物转化仍然根本上受制于细胞氧化还原代谢。高附加值化学品的生物合成通常需要大量NADPH，导致胞内氧化还原失衡和细胞适应性下降，从而降低碳利用效率并限制产品得率。因此，克服氧化还原约束已成为开发高性能甲醇生物转化平台的核心挑战。

乙醇酸（GA）是一种多功能平台化学品，广泛应用于化妆品、制药、纺织加工和特种化学品领域。更重要的是，它是聚乙醇酸（PGA）的关键单体，PGA是一种完全可生物降解的聚合物，已成为传统石油基塑料的有前景替代品（Samantaray et al., 2020）。然而，目前工业生产中乙醇酸的制备很大程度上依赖石化原料和多步化学合成过程，这伴随着大量碳排放，且常产生增加聚合物级单体下游纯化成本的副产物（Kang et al., 2022）。与此同时，利用可再生碳水化合物底物微生物发酵生产乙醇酸也日益受到关注。近期在各微生物宿主中的代谢工程研究已证明生物合成乙醇酸的可行性（Cheng et al., 2026, Deng et al., 2018, Yi and Ng, 2023），滴度最高可达81.5 g/L，得率达0.49 g/g（Cheng et al., 2026）。然而，这些已建立的生物合成路线主要依赖糖类底物，导致原料成本高且可能与粮食生产竞争，从而限制了其长期可持续性和大规模应用。因此，开发以CO₂衍生甲醇为底物的可持续生物合成路线，为实现乙醇酸的绿色可再生与选择性生产提供了有前景的替代方案。

在此，我们通过建立高效的甲醇生物转化平台，实现了化学-生物协同制造的闭环，将上游高效的CO₂到甲醇转化与下游选择性生物升级有机衔接。具体而言，我们通过辅因子中性的代谢重编程改造了毕赤酵母（Komagataella phaffii）细胞工厂，解决了甲醇同化过程中细胞生长与NADPH依赖型乙醇酸生物合成之间的本征冲突。这一策略显著提高了乙醇酸生物合成的产品得率，同时减轻了NADPH密集型生产带来的适应性负担。工程菌株在5 L生物反应器中实现了0.41 g/g的创纪录乙醇酸得率和41.2 g/L的滴度。生命周期评估进一步表明，与化石基路线相比，该路线的全球变暖潜势降低了59.0%。

章节摘要

菌株、质粒与培养基

本研究中使用的所有菌株、质粒和引物列于表S9?11。研究中使用的基因、启动子和终止子序列列于表S12和S13。用于gRNA质粒构建的E. coli DH5α在LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl）中于37°C、220 rpm摇床培养。改造的K. phaffii菌株以HIS4营养缺陷型K. phaffii PC111为出发菌株构建。其他改造的K. phaffii菌株在以下条件下构建

基于甲醇的乙醇酸生物合成途径构建

为在K. phaffii中建立从甲醇高效生产乙醇酸的生物合成路线，我们首先尝试从丙氨酸循环中间体乙醛酸出发构建一条功能性途径（图1和2A）（Deng et al., 2018, Yu et al., 2020）。最初的工程改造聚焦于在强甲醇诱导型P_AOX1启动子下过表达内源乙醛酸还原酶基因Pp_GOR1（菌株pGR01）。然而，这一改造未能检测到乙醇酸。类似地，

结论

综上所述，本研究通过对K. phaffii进行代谢重编程，建立了高效的甲醇生物转化平台用于乙醇酸生产。具体而言，通过构建辅因子中性生物合成路线并实施多区室代谢工程，工程菌株实现了0.41 g/g的创纪录乙醇酸得率和41.2 g/L的滴度。生命周期评估表明，与传统化石基路线相比，该路线的全球变暖潜势（GWP）降低了59.0%。总体而言，本研究

CRediT作者贡献声明

韦芳晴：初稿撰写、可视化、方法学、调查研究、形式分析、概念构思。韩晓：审阅与编辑、监督指导、概念构思。徐平：审阅与编辑、监督指导、资金获取。陶飞：审阅与编辑、监督指导、资金获取。

生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的使用声明

在本工作准备过程中，作者仅使用ChatGPT（OpenAI）改进手稿的语言和可读性。作者对输出内容进行了审阅和编辑，并对文章的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（项目编号 32470095 和 32400057）、上海交通大学双一流建设计划、上海市科技重大专项以及上海市科学技术委员会（项目编号 24HC2820800 和 25HC2810600）以及协同化学生物合成国家重点实验室自主项目（sklscbs202588）的支持。本研究项目（"碳负

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