人乳酸脱氢酶A的稳态动力学表征与机理建模：作为抑制剂筛选的参考框架

《Bioorganic Chemistry》：Steady-state kinetic characterization and mechanistic modeling of human lactate dehydrogenase A as a reference framework for inhibitor screening

　　

摘要

人类乳酸脱氢酶 A (hLDH-A) 是癌症相关代谢重编程中的关键酶，催化丙酮酸和乳酸之间的可逆互变，偶联 NADH/NAD⁺ 氧化还原对。因此，严格的动力学参考对于可靠评估 hLDH-A 的调节至关重要，特别是在基于酶的药物筛选背景下。在本研究中，通过分析正向和反向反应，在类生理条件下系统地表征了 hLDH-A 的稳态动力学。

利用 Michaelis–Menten 模型和 Hanes–Woolf 线性化确定表观动力学参数，并以未转换数据的非线性拟合作为补充，同时假设有序序列双底物 (bi–bi) 机制提取本征动力学常数。结果显示对丙酮酸到乳酸的反应表现出明显的偏好，这主要由辅因子依赖性步骤驱动，而非底物亲和力。所建立的动力学框架随后被应用于参考 LDH 抑制剂的比较评估，能够区分竞争性、非竞争性和混合抑制机制，并确定抑制常数。特别是，氧甲戊二酸 (oxamate) 表现出相对于丙酮酸的竞争性抑制，而加洛黄酮 (galloflavin)、棉酚 (gossypol) 和 FX11 主要表现出非竞争性行为。NHI-2 显示出混合抑制模式。在丙酮酸变化条件下确定的抑制常数范围为 6.9 至 52.5 μM，其中棉酚在受调查化合物中显示出最高的抑制效力。基于确定的动力学参数，开发了一个描述净反应速率的机理模型，以模拟酶促系统的时间演化。该模型捕捉了实验观察到的 NADH 消耗的主要趋势，并定性再现了与竞争性和非竞争性抑制机制相关的不同动力学效应。

引言

酶是所有生物过程的关键调节因子，控制着维持细胞功能的代谢反应的速率和方向性 [1], [2]。由于其核心作用，其活性、调节或表达的改变与多种病理状况有关，包括代谢疾病、癌症、神经退行性疾病和炎症性疾病 [3], [4]。因此，酶代表了一大类治疗靶点，通过小分子对其进行调节仍然是现代药物发现的基石 [3], [5], [6]。

对酶动力学的详细理解对于酶靶向治疗的理性设计和评估至关重要。动力学参数提供了关于催化效率、底物亲和力和反应可逆性的定量见解，使能够对酶行为进行超出定性活性测量的机理解释 [7], [8], [9]。在缺乏稳健动力学框架的情况下，底物浓度、辅因子可用性或环境条件的变化可能导致对酶活性的模糊或误导性解释。对于催化可逆反应的酶，这一问题变得尤为相关，因为其表观活性反映了正向和反向过程之间的动态平衡，因此对周围化学环境高度敏感 [10], [11]。建立此类系统的严格动力学描述是任何后续评估酶功能扰动（包括由外部调节剂引起的扰动）的先决条件。

酶动力学在以代谢失调为特征的病理状况中显得尤为重要。癌症是一个典范例子，因为肿瘤细胞经历广泛的代谢重编程以维持快速增殖，同时适应营养受限的环境 [12], [13], [14], [15], [16], [17]。这些代谢适应主要是由酶活性和调节的改变驱动的，而不是由全新的代谢途径的出现驱动的，这强调了酶功能在癌症生物学中的核心作用 [18]。

癌症相关代谢改变通过全球流行病学预测进一步凸显了其临床相关性，这些预测预测到 2050 年癌症发病率和死亡率将在全球范围内大幅上升，分别约为 65–80% 和 75–90% [19]。这些因素促使开发稳健的生物化学工具，以受控地表征参与癌症相关代谢的酶。在参与癌症相关代谢途径的酶中，乳酸脱氢酶 (LDH) 占据核心地位 [17], [18], [20], [21], [22], [23]。LDH 催化丙酮酸到乳酸的可逆转化，偶联 NADH/NAD⁺ 氧化还原对，从而直接将糖酵解通量与细胞氧化还原稳态联系起来。该反应代表一个关键代谢节点，因为它调节氧化代谢和厌氧糖酵解之间的平衡，同时维持高糖酵解速率所需的持续 NAD⁺ 再生 [18], [24], [25], [26]。

LDH 的相关性，特别是其亚型 A (LDH-A)，在瓦博格效应 (Warburg effect) 的背景下显得尤为明显，这是癌症代谢的一个标志，其特征是在有氧条件下也优先将丙酮酸转化为乳酸 [27], [28], [29]。LDH-A 主要表达于高糖酵解组织，并经常在癌细胞中上调。据报道，LDH-A 表达增加见于广泛范围的实体瘤，并与增强的糖酵解通量、肿瘤侵袭性和预后不良相关 [12], [14], [26], [30], [31]。

通过促进乳酸产生，LDH-A 不仅贡献于代谢重接线，还贡献于肿瘤微环境酸化。这一过程促进了肿瘤侵袭、免疫逃逸和治疗耐药。鉴于其在糖酵解、氧化还原平衡和肿瘤微环境重塑交汇处的关键作用，LDH-A 因此已成为癌症相关代谢研究中广泛调查的生物化学靶点。

重要的是，LDH-A 的选择性抑制被认为潜在安全，因为先天性 LDH-A 缺乏的个体表现出相对轻微的临床症状 [31], [32], [33], [34], [35], [36]。然而，尽管对 LDH-A 作为治疗靶点有浓厚兴趣，但用于评估 hLDH-A 催化和抑制的全面且标准化的动力学框架仍然有限。既往研究往往专注于 LDH-A 行为的选定方面，如一个反应方向、特定底物或辅因子条件，或单个抑制剂，而不是在单一实验框架内整合正向和反向动力学、底物和辅因子依赖性、本征动力学参数、抑制机制和反应建模。此外，测定配置可能在 pH、温度、缓冲液组成、酶来源、底物和辅因子浓度、可变配体以及用于表达抑制剂效力的动力学参数方面存在差异。这种变异性可能使抑制机制的解释复杂化，并限制跨研究的抑制剂性能直接比较。因此，需要全面且受控的动力学参考框架，以支持对 hLDH-A 调节更一致的评估。

在本研究中，呈现了人类 LDH-A (hLDH-A) 的详细动力学分析，在受控条件下系统地调查了正向和反向催化反应。由于 LDH 催化一个可逆反应，分析两个催化方向对于定义酶的本征动力学行为并描述底物、产物和辅因子依赖性步骤之间的平衡很重要。本工作的目标不是鉴定新的 hLDH-A 抑制剂，而是建立一个标准化动力学框架，以支持对 hLDH-A 催化和抑制的机理解释。为此，选定的已知 LDH 抑制剂，即氧甲戊二酸 (oxamate)、加洛黄酮 (galloflavin)、NHI-2、FX11 和棉酚 (gossypol)，被用作基准化合物，以评估在一致实验条件下如何区分不同的抑制机制。尽管反应的两个方向都很相关，但在癌症相关糖酵解代谢的背景下，丙酮酸到乳酸的方向对抑制剂评估最相关，因为它直接支持 NAD+ 再生和乳酸产生。因此，完整的动力学表征包括两个反应方向，而抑制剂分析则集中于受控且生理相关条件下的正向反应。

这种方法的一个独特方面是，通常在单独调查中涉及多个动力学特征，包括反应方向性、底物和辅因子依赖性、本征动力学常数、抑制机制和反应可逆性，都在单一实验和机理框架内考虑。此外，基于实验确定的参数开发了一个最小机理动力学模型，以支持反应可逆性和抑制剂依赖性动力学行为的解释。通过建立稳健且定义明确的动力学参考框架，本工作旨在提供关于 hLDH-A 行为的基本见解，并支持未来在受控体外条件下开发用于 hLDH-A 调节生物化学评估的分析和生物传感策略，从而可能更快鉴定潜在治疗分子。

章节片段

材料

乙醇，丙酮，KH₂PO₄，K₂HPO₄，1-羟基 -6-苯基 -4-(三氟甲基)-1H-吲哚 -2-羧酸甲酯 (NHI-2)，二甲基亚砜 (DMSO)，以及在大肠杆菌 (Escherichia coli) 中表达的人类 L-乳酸脱氢酶 (hLDH-A, EC 1.1.1.27) 由 Sigma-Aldrich (Merck) 提供。乳酸，丙酮酸钠，加洛黄酮，NADH 和 NAD 购自 VWR Avantor。7-苄基 -2,3-二羟基 -6-甲基 -4-丙基 -1-萘酸 (FX11) 由 BLDpharm 提供。棉酚和氧甲戊二酸钠盐

基于 NADH 的光谱监测的光学验证

反应混合物中涉及的所有化学物种的紫外 - 可见吸收光谱显示在图 1 中，并以任意单位的吸光度值报告。

NAD⁺ 和 NADH 在 260 nm 左右的紫外区域显示出特征吸收带，这归因于腺嘌呤的 π → π* 跃迁，两种辅因子共有。此外，NADH 显示出以 340 nm 为中心的清晰吸收带，这在 NAD⁺ 的光谱中缺失，源于

结论

在本研究中，通过全面且机理的方法系统地调查了人类乳酸脱氢酶 A (hLDH-A) 的动力学行为。在类生理条件下确定了正向和反向反应的稳态动力学参数，使得在有序序列双底物催化机制框架内鉴定本征动力学常数成为可能。

动力学分析揭示了两个反应之间明显的不对称性

CRediT 作者贡献声明

Chiara Vincenzi: 写作 – 原稿。 Edoardo Bocina: 调查。 Debora Fino: 写作 – 审阅与编辑。 Carminna Ottone: 监督，调查。 Marco Piumetti: 写作 – 审阅与编辑，监督，调查。

资金来源

未申报竞争性财务利益。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或人际关系，这些利益或关系可能会影响本文报告的工作。

Chiara Vincenzi|Edoardo Bocina|Debora Fino|Carminna Ottone|Marco Piumetti

都灵理工大学应用科学与技术系，意大利都灵 Corso Duca degli Abruzzi 24, 10129