新型 β-内酰胺 - 奥克他定纳米 GUMBOS：应对慢性伤口感染相关细菌的极具前景的平台

《Bioorganic Chemistry》：Novel β-lactam–Octenidine nanoGUMBOS: A promising platform to address Bacteria linked to chronic wound infections

　　

摘要
抗菌药物耐药性是全球公共卫生面临的重大挑战，在慢性伤口（CW）中尤为突出，细菌定植和生物膜形成会阻碍伤口愈合并促进持续感染。传统抗生素对多重耐药病原体疗效有限，凸显了对创新抗菌策略的需求。本研究旨在开发并评估β-内酰胺-辛酰胍纳米GUMBOS，作为用于慢性伤口管理的多功能抗菌纳米材料。本研究通过简单无添加剂的再沉淀法合成三种纳米GUMBOS：[OCT][Cftx]、[OCT][Cflt]和[OCT][Cfpz]。采用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征其物理化学性质。在成纤维细胞（L929）和角质形成细胞（HaCaT）细胞系中评估其细胞相容性，并通过最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定，评估其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性。DLS和TEM分析证实形成了均一的球形纳米颗粒，直径约100纳米，低多分散性（PDI<0.2）。所有化合物在最高9微摩尔浓度下均无细胞毒性，且细胞存活率高于其前体盐。[OCT][Cftx]和[OCT][Cflt]表现出最强的抗菌活性，MIC值低至4.5微摩尔，优于体相GUMBOS和单独的前体化合物。本研究引入了一类新型多功能抗菌纳米GUMBOS，证明纳米尺度组装可在维持良好细胞相容性的同时增强β-内酰胺-辛酰胍GUMBOS的抗菌性能。据我们所知，这是首次报道β-内酰胺-辛酰胍纳米GUMBOS，其采用简单、自动且无添加剂的合成方法获得，与体相GUMBOS和前体化合物相比，凸显了其作为慢性伤口治疗平台的前景。

引言
抗菌药物耐药性目前已成为最严重的全球公共卫生威胁之一，严重削弱了传统细菌感染的治疗效果。多重耐药细菌日益普遍，显著减少了可用的治疗选择，导致原本易于治疗的感染相关的发病率、死亡率和成本上升。导致这一局面的主要病原菌包括ESKAPE组——屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属——它们以高毒力、对多种抗生素产生耐药性、形成生物膜以及在医院环境中持续存在而闻名[1]。

尽管问题严峻，新型抗生素的研发却十分稀少。2000年至2024年间，美国食品药品监督管理局仅批准了约20种具有新分子实体的抗生素，占同期所有新上市药物的3%以下，与其他治疗领域（如肿瘤学和罕见病）的显著较高批准数量形成鲜明对比[2]、[3]、[4]。这表明药物研发管线几乎处于停滞状态，主要原因在于开发新型抗菌化合物的科学复杂性、高昂的成本以及缺乏显著的经济和政治激励[5]。

在慢性伤口背景下，这一局面尤为令人担忧，因为多重耐药微生物的定植严重阻碍了生理愈合过程，有利于持续感染和复发的发生。此类伤口中常见的细菌生物膜作为物理和生化屏障，阻碍了抗菌剂和免疫细胞的作用，使得根除感染变得困难。在这些情况下，有效的治疗策略需要局部、快速且靶向的抗菌干预，因为单独的系统性治疗往往不够充分。在没有明确益处和可靠科学证据的情况下，不当使用系统性抗生素会使患者面临不必要的风险，包括不良反应和继发感染，并显著加剧细菌抗生素耐药性的上升[5]、[6]、[7]。

鉴于有效治疗选择日益匮乏，联合治疗策略已占据重要地位。该方法基于同时使用两种或多种具有互补或不同作用机制的抗菌剂或生物活性剂。合理使用抗菌联合，特别是在外用制剂中，因此成为改善被各种多重耐药细菌定植的伤口（如慢性伤口）临床结果的有前景的替代方案[8]、[9]。多项近期研究探索了不同的联合治疗组合，包括两种传统抗生素的联合（例如链霉素与利福平联合抗结核分枝杆菌[MTB]）[10]、抗生素（如阿奇霉素、庆大霉素或苯甲异噁唑青霉素）与抗菌肽（AMPs）联合抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌[11]，以及天然化合物（如红色蜂胶）与传统抗生素（如庆大霉素或亚胺培南）协同抗铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌[8]、[12]。与此同时，各种基于纳米技术的方法作为单独传统抗生素的替代方案应运而生。抗菌纳米颗粒（如银纳米颗粒[AgNPs]）与庆大霉素等抗生素联合，已显示出对表皮葡萄球菌的协同活性。据报道，这些纳米颗粒可穿透细菌细胞壁、破坏细胞膜并诱导细菌死亡。总体而言，纳米材料与抗生素联合时表现出协同抗菌效果[13]、[14]。尽管许多这些模型已在体外或临床前模型中证明有效，但其向临床实践的转化仍受限于制剂稳定性、局部毒性（尤其是外用应用）以及缺乏可靠的临床试验等挑战。

这一背景凸显了需要创新策略，不仅结合抗菌剂，还需利用纳米尺度制剂。一类有前景的材料是基于有机盐的均匀材料（GUMBOS），由功能离子对合成，熔点介于25°C和250°C之间。此前研究已从抗生素和消毒液中开发GUMBOS——例如氯己定与β-内酰胺抗生素结合——证明了其稳定性和协同抗菌活性的提高[15]，以及氟喹诺酮类GUMBOS[16]。然而，纳米尺度制剂对抗菌GUMBOS的影响仍很大程度上未被探索，尤其是结合消毒液和β-内酰胺抗生素的系统。

本研究通过将由辛酰胍和β-内酰胺GUMBOS转化为纳米GUMBOS来解决这一空白。与体相对应物相比，纳米GUMBOS可能提供与纳米系统相关的优势，包括改善与细菌细胞和生物膜的相互作用、调节生物反应的潜力，同时维持材料本身的固有药学功能。此外，纳米GUMBOS因其毒性调节、更大的制剂灵活性以及简单合成而受到关注[17]、[18]。选择头孢曲松、头孢噻吩和头孢哌酮作为β-内酰胺对应物，因为它们是具有临床相关性的β-内酰胺抗生素，属于不同代次头孢菌素，表现出不同的结构特征和抗菌谱，允许评估β-内酰胺组分如何影响所得纳米GUMBOS的物理化学和生物学特性。

本研究的目的是合成并表征β-内酰胺-辛酰胍纳米GUMBOS，并评估其对具有临床相关性的伤口相关病原体的细胞相容性和抗菌活性。我们假设将β-内酰胺-辛酰胍GUMBOS转化为纳米GUMBOS可在维持良好细胞相容性的同时增强抗菌性能。据我们所知，这是首次报道基于辛酰胍与β-内酰胺抗生素结合的纳米GUMBOS，并系统评估纳米化对这些系统生物学性能影响的研究，为开发用于慢性伤口管理的多功能抗菌系统提供了新策略。

在本工作中，合成并表征了三种将辛酰胍与头孢曲松、头孢噻吩和头孢哌酮结合的纳米GUMBOS（图1）。评估了它们及其各自前体的细胞毒性，采用两种与皮肤相关的细胞系，即成纤维细胞（L929）和角质形成细胞（HaCaT）。通过测定最小抑制浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），对三种ATCC（LGC Standards）参考菌株（包括一种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌）进行体外抗菌活性评估。选择三种在慢性感染伤口中具有高度临床相关性的细菌：大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

材料
纳米GUMBOS合成所需的前体头孢曲松二钠盐半七水合物、头孢噻吩钠盐、头孢曲松钠盐和辛酰胍二盐酸盐均购自Sigma-Aldrich?（美国密苏里州圣路易斯）。无水乙醇购自Carlo Erba（法国瓦勒德吕尔）。所有制备的溶液均使用Milli-Q?专用纯化水系统（18.2兆欧厘米，Healforce，中国上海）获得的高纯水。细胞培养试剂，包括杜尔贝科……

纳米GUMBOS的表征
合成三种纳米GUMBOS后，使用DLS/PALS、TEM和FTIR评估了其物理化学特性。表1总结了直径、多分散性指数（PDI）和Zeta电位（ZP）数据。流体动力学直径在100至118纳米之间，证实形成了具有高表面积体积比的小纳米颗粒，这有利于潜在的胶体稳定性。同样重要的是强调，所得纳米GUMBOS尺寸……

结论
在本工作中，使用再沉淀法合成了三种基于辛酰胍和β-内酰胺抗生素的纳米GUMBOS，采用了简单且自动化的合成过程。研究了这些化合物的特性，并评估了其细胞毒性和作为抗菌剂的潜在效果。所采用的方法被证明是可重复且通用的，允许生成纳米结构化和稳定制剂，使该方法成为……的有前景的工具。

CRediT作者贡献声明
Fátima A.R. Mota：撰写——初稿、可视化、方法、调查、形式分析、数据管理、概念构思。Fábio M.S. Costa：形式分析。Ana Isabel Barbosa：撰写——审阅与编辑、方法、概念构思。Andreia Granja：撰写——审阅与编辑、方法、调查。Salette Reis：撰写——审阅与编辑、资源、方法。Mariana Ferreira：撰写——审阅与编辑、验证、方法、调查。Paula Gameiro：撰写……

利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢
本工作获得了葡萄牙国家资金（FCT/MECI，科学和技术基金会及教育、科学和创新部）通过项目UID/50006/2025 DOI 10.54499/UID/50006/2025 - 绿色化学联合实验室 - 清洁技术和工艺的财政支持。Fátima A. R. Mota感谢FCT（科学和技术基金会）和ESF（欧洲社会基金）通过POCH（人力资本运作计划）提供的博士奖学金（编号：2022.09611.BD）。Andreia……

Fátima A.R. Mota|Fábio M.S. Costa|Ana Isabel Barbosa|Andreia Granja|Salette Reis|Mariana Ferreira|Paula Gameiro|Marieta Passos|Jo?o L.M. Santos|M. Lúcia M.F.S. Saraiva
LAQV-REQUIMTE，应用化学实验室，波尔图大学药学院，Jorge Viterbo Ferreira街228号，4050-313，葡萄牙波尔图