通过双金属杂化纳米花中的自组装固定化增强猪胰脂肪酶的催化性能以高效合成乙酸异丙酯

《Bioresource Technology Reports》：Enhanced catalytic performance of porcine pancreatic lipase via self-assembled immobilization in bimetallic hybrid nanoflowers for efficient isopropyl acetate synthesis

　　

摘要

酶催化风味酯生产提供了一种有效的生物催化方法。本研究探讨了将猪胰脂肪酶（PPL）固定化在双金属Ca/Zn3(PO4)2杂化纳米花（PPL-HNFs）中，作为在正己烷中合成乙酸异丙酯的高效可重复使用生物催化剂。PPL-HNFs的固定化产率为85%，活性回收率为510%，高于单金属Ca基和Zn基纳米花的水平。在p-硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP）存在下，PPL-HNFs的表观Km值为0.0078 mM，比游离PPL低1.7倍。经过10个循环后，PPL-HNFs在p-NPP水解测定中保留了58.4%的残余活性，在乙酸异丙酯合成中保留了47.71%的初始活性，表明具有操作可回收性。热力学分析证实了PPL-HNFs具有更高的结构稳定性和热稳定性，导致PPL-HNFs的t1/2值更高，与游离脂肪酶相比失活能约高出2倍。采用响应面法（RSM）结合中心复合设计（CCD）对乙酸异丙酯合成进行了优化，在40°C、24小时反应时间、异丙醇与乙酸4:1摩尔比、正己烷中酶浓度7 mg mL?1的条件下，PPL-HNFs的预测转化率可达90.915%。实验验证所得平均转化率为89.045%，与预测值高度吻合。实验验证的PPL-HNFs转化率比游离PPL高出21.18个百分点。总体而言，这些发现凸显了双金属PPL-HNFs作为酶固定化平台的潜力，并为开发有效风味酯合成生物催化剂提供了有前景的策略。

引言

风味酯是多种有机芳香化合物，广泛应用于饮料、食品、制药和化妆品行业（Ramon Tomé Oliveira等，2025；Sá等，2017）。乙酸异丙酯（IPAc）作为短链脂肪族酯的成员，是一种具有果香味的溶剂，用于生产印刷油墨、合成树脂和香料香精。IPAc传统上通过乙酸与异丙醇的酯化反应合成（Qi和Malone，2011；Ramon Tomé Oliveira等，2025；Verma等，2011）。然而，反应精馏等化学生产方法需要有毒试剂、高能量输入和多次纯化步骤，增加了工艺复杂度和成本。此外，共沸物的形成导致复杂相分离，使产品纯化困难（Qi和Malone，2011；Zhao等，2018）。

相比之下，酶促酯化提供了一种选择性强且温和的替代方法，可以最大限度减少副产物生成、反应物损失、有毒试剂使用、能量消耗和生产成本，同时提高产品质量（Badoei-Dalfard等，2026a；Badoei-Dalfard等，2026b；Mustafa和Niikura，2022）。脂肪酶（EC 3.1.1.3）是功能多样的生物催化剂，能够以高区域选择性、化学选择性和立体选择性催化合成和水解反应，使其适用于在温和条件下无溶剂或非水介质中的酯合成（Badoei-Dalfard等，2026a；Badoei-Dalfard等，2026b；Ferreira Gon?alves等，2021；Park和Park，2022；Sampaio等，2022）。然而，微生物脂肪酶（如芽孢杆菌或青霉属）的高成本可能限制其工业应用。相比之下，猪胰脂肪酶（PPL）是一种具有成本效益且稳定的替代方案，可用于风味酯的酶催化合成（Vescovi等，2017）。PPL具有结构稳定的活性位点，在有机溶剂中催化酯化反应效果显著（Mendes等，2012）。

脂肪酶催化过程中的主要限制之一是酶不稳定，暴露在恶劣条件（如极端pH值和温度）下会导致酶快速失活。此外，酶回收效率低且可重复使用性有限，在工业规模上造成经济挑战（Maghraby等，2023；Ramon Tomé Oliveira等，2025；Suo等，2022）。通过交联、包埋、吸附和共价结合实现的酶固定化已被开发为提高酶稳定性的方法之一（Abellanas-Perez等，2025；Hasnaoui等，2025；Mohammadi-Mahani等，2021；Sá等，2025）。通过不同策略实现的酶固定化已提高了基于脂肪酶的风味合成的工业可行性（Jacob等，2022；Suo等，2022；Taghizadeh等，2021）。然而，固定化结果强烈依赖于载体材料的适当选择和固定化过程设计，因为结构改变、活性位点不可及性和扩散限制可能导致催化活性降低（Bolivar等，2022；Ling等，2025；Yildiz-Dalginli，2025）。

自2012年Ge及其研究团队引入蛋白质-Cu3(PO4)2无机纳米花合成策略以来，生物分子金属磷酸盐杂化系统的设计与开发已成为一个不断增长的领域（Ge等，2012）。这些杂化纳米花（HNFs）是通过生物分子与金属磷酸盐纳米片的配位形成的具有分层架构的三维花状结构。其分级结构提供了高比表面积，增强了酶负载量，减少了传质限制，并提高了催化性能。简单的、环保的、一步法合成途径使HNFs成为酶固定化的有前景的平台，有助于克服传统方法的局限性（Aydemir等，2024；Han等，2024；Jafari-Nodoushan等，2022；Zhang等，2021；Zhang等，2025；Zhao等，2025）。

金属离子在决定杂化纳米花的晶体生长、形貌、酶-金属配位和催化行为方面发挥重要作用。它们与蛋白质酰胺基团的配位可调节酶活性，而金属离子的类型和浓度影响纳米花的架构和包埋效率（Jafari-Nodoushan等，2022；Li等，2020a；Li等，2020b；Li等，2020c；Wen等，2020）。在单金属系统中，基于Cu2+的纳米花已被用于脂肪酶固定化（Cui等，2016；Lee等，2017）。例如，GA处理的脂肪酶/Cu2+纳米花比游离脂肪酶活性高出160%（Ling等，2025）。然而，它们相对较软的结构以及铜离子相关的环境顾虑可能限制其实际应用。相比之下，Ca2+提供生物相容性结构，Zn2+可能增强酶-金属相互作用，增加包埋产率，并创造更致密的纳米花（Amorim等，2025；Anboo等，2024；Patel等，2019；Yu等，2018）。Ca2+在纳米花形成和脂肪酶活化中发挥双重作用。Zhang等报告称Ca2+诱导ZC12/Ca3(PO4)2纳米花的形成并促进活性脂肪酶构象的保持，与游离脂肪酶相比活性提高了206%（Zhang等，2020）。同样，Ke等表明含头孢菌素脂肪酶的Ca3(PO4)2基纳米花表现出308%的催化活性增强，归因于Ca2+介导的脂肪酶盖结构调节和底物可及性改善（Ke等，2016）。此外，对不同单独金属离子在大米曲霉脂肪酶杂化纳米花上的研究表明，Ca2+、Zn2+和Mn2+作为二价离子有利于形成更具活性的纳米花，而Ag+、Al3+和Fe3+则导致活性降低，强调了金属离子种类和价态在杂化纳米花性质中的重要性（Li等，2020a；Li等，2020b；Li等，2020c）。

虽然单金属基酶纳米花通常表现出增强的活性，但由于纳米花质地柔软脆弱，影响其可重复使用性和机械强度，其工业应用受到限制（Del Arco等，2021；Patel等，2019）。为克服这些局限性，多金属基杂化纳米花被开发为替代策略。例如，Cu2+/Zn2+基漆酶纳米花表现出比单金属系统更高的包埋效率和可重复使用性，且比游离漆酶活性高2.6倍（Patel等，2019）。此外，含碳酸酐酶的Cu2+/Zn2+磷酸盐纳米花表现出比游离酶高5.2倍的CO2捕获效率（Wen等，2020）。

先前的双金属系统通过不同金属离子与酶分子之间的协同相互作用表现出增强的酶负载量、催化活性和可重复使用性；然而，这些报道主要针对非脂肪酶类的酶（Iranmanesh等，2025；Patel等，2019；Wen等，2020）。尽管Ca2+和Zn2+的单独效应已在不同的脂肪酶纳米花系统中报道，但据我们所知，Ca2+和Zn2+在猪胰脂肪酶（PPL）杂化纳米花中的协同效应尚未被研究。因此，我们假设这些互补金属离子的结合可能通过整合其先前报道的对脂肪酶活化和结构稳定的效应，提供有利的金属离子环境，从而改善PPL在风味酯合成中的催化性能和稳定性。

响应面法（RSM）是一种用于建模和优化多变量系统的统计工具。使用CCD或BBD设计，RSM通过比传统方法更少的实验评估变量间的相互作用，并结合方差分析（ANOVA），在生物化学和工业应用中预测最优条件（Liu等，2025；Raghavendra等，2014）。

在本研究中，PPL通过一锅法自组装策略固定化在Ca2+/Zn2+基杂化纳米花（PPL-HNFs）中，用于在正己烷中合成乙酸异丙酯（图1）。该方法旨在探讨Ca2+和Zn2+离子对纳米花形成、酶稳定和PPL催化性能的协同贡献，提供一种高效可重复使用的生物催化平台。对PPL-HNFs的动力学、形貌、热力学和操作稳定性特性进行了评估。此外，采用RSM结合CCD对影响乙酸异丙酯合成的相关参数进行了优化，并在优化结果下对游离PPL和固定化PPL进行了比较。

各部分片段

材料与仪器

p-硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP）和猪胰脂肪酶（PPL）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。氯化钾（KCl）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（NaCl）、硫酸锌七水合物（ZnSO4·7H2O）和硫酸钙二水合物（CaSO4·2H2O）购自Merck（德国）。所有实验均使用纯水（电阻率：18.2 MΩ·cm，Milli-Q Integral 5，Millipore）完成。场发射扫描……

PPL-HNFs的合成

双金属杂化纳米花（PPL-HNFs）通过在PBS（pH 7.4）中将CaSO4和ZnSO4溶液与PPL在4°C下一锅法组装72小时构建而成，如图1所示（Ge等，2012）。无机杂化纳米花的构建有利于稳定酶结构和活性，因为其合成不使用有机溶剂（Liu等，2021）。根据现有报道，酶杂化纳米花的形成是三步机制，其中……

结论

本研究探讨了双金属（Ca2+和Zn2+）杂化纳米花作为猪胰脂肪酶（PPL）自组装固定化平台的有效性及其在乙酸异丙酯合成中的应用。与单金属纳米花相比，Zn2+和Ca2+的互补作用促进了稳定的分级纳米花结构的形成，改善了酶包埋和可重复使用性，并增强了催化性能。PPL的固定化改善了……

CRediT作者贡献声明

Arastoo Badoei-Dalfard：写作——审阅与编辑、验证、监督、资源、形式分析、概念构思。Fatemeh Mashayekhi：写作——初稿撰写、方法论、调查、数据管理。Samira Iranmanesh：写作——审阅与编辑、方法论、调查、形式分析。Zahra Karami：写作——审阅与编辑、可视化、验证、监督、形式分析。

伦理与参与同意

不适用。

发表同意

不适用。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Arastoo Badoei-Dalfard报告获得了伊朗国家科学基金会的财政支持。如有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述工作。

致谢

作者感谢克尔曼沙希德巴霍纳大学科研委员会（伊朗克尔曼）和（INSF：伊朗国家科学基金会，资助编号：4030090）在本项目期间的财政支持。

Arastoo Badoei-Dalfard | Fatemeh Mashayekhi | Samira Iranmanesh | Zahra Karami

克尔曼沙希德巴霍纳大学理学院生物系，伊朗克尔曼