《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》：Mannose-appended aminated polyrotaxane for the antigen delivery to antigen-presenting cells
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基于蛋白抗原的疫苗因安全性高、可诱导体液与细胞免疫而被广泛使用，但蛋白抗原存在细胞膜通透性差、易被内源酶及内体/溶酶体降解等问题。为诱导高效免疫应答，抗原须被递送至抗原提呈细胞(APC)。研究人员此前开发了胺化聚轮烷，其氨基可沿聚乙二醇(PEG)链移动，按需适
基于蛋白抗原的疫苗因安全性高、可诱导体液与细胞免疫而被广泛使用，但蛋白抗原存在细胞膜通透性差、易被内源酶及内体/溶酶体降解等问题。为诱导高效免疫应答，抗原须被递送至抗原提呈细胞(APC)。研究人员此前开发了胺化聚轮烷，其氨基可沿聚乙二醇(PEG)链移动，按需适配生物药的形状与电荷分布并形成复合物；进一步开发的第二代胺化聚轮烷(2G)具有优异的内体逃逸能力，但缺乏APC靶向配体。本研究将4-异硫氰酸苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(Man-Phe)偶联至2G，得到Man-Phe-2G。Man-Phe-2G与模型抗原卵清蛋白(OVA)形成复合物，在小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)中的摄取显著高于2G/OVA；其可上调抗原提呈分子主要组织相容性复合体Ⅰ/Ⅱ(MHCⅠ/Ⅱ)与共刺激分子CD80/CD86表达，促进BMDC产生白细胞介素-12(IL-12)，并在体内提升抗OVA免疫球蛋白G(IgG)水平。结果表明，Man-Phe-2G是一种有潜力的APC靶向蛋白抗原递送载体。
论文解读：《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》报道了研究人员关于甘露糖修饰胺化聚轮烷作为蛋白抗原递送载体的研究。
研究背景方面，蛋白抗原疫苗具有安全性高、可同时诱导体液免疫与细胞免疫的优势，但蛋白抗原面临三大问题：易被内源酶降解、细胞膜通透性低、进入细胞后易在内体/溶酶体中被降解。现有脂质体、聚合物、纳米颗粒等载体存在蛋白包封率低或与抗原蛋白相互作用位点空间不匹配的问题。胺化聚轮烷由环糊精(CD)穿于聚乙二醇(PEG)链并以封端分子构成聚轮烷后再引入氨基得到，其氨基可沿PEG链移动，从而识别并适配蛋白的形貌与电荷分布，已用于 siRNA、反义寡核苷酸、mRNA、β-半乳糖苷酶、抗体及基因组编辑蛋白复合物等生物药的递送。第二代胺化聚轮烷(2G)以二亚乙基三胺(DET)修饰，具备内体逃逸能力，并可携卵清蛋白(OVA)进入抗原提呈细胞(APC)，但2G本身无APC选择性配体。树突状细胞等APC高表达甘露糖受体(CD206)，甘露糖具有生物相容性好、低免疫原性、分子量小、成本低的特点，因此研究人员假设将2G用甘露糖修饰可实现抗原向APC的选择性递送，并据此构建 Man-Phe-2G 开展系统评价。
主要关键技术方法方面，研究人员以 C57BL/6J 小鼠骨髓来源细胞经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导获得骨髓来源树突状细胞(BMDC)；通过核磁表征 Man-Phe-2G 取代度，以粒径与ζ电位分析 Man-Phe-2G/OVA 复合物；用流式细胞术检测 CD206 表达、细胞摄取、甘露聚糖竞争抑制、DC 成熟标志物；以酶联免疫吸附试验(ELISA)测定 IL-12 与干扰素-γ(IFN-γ)；体内采用 C57BL/6Jms 小鼠皮下免疫评估抗OVA IgG、血液生化安全性与细胞毒性。
研究结果如下。
3.1 Man-Phe-2G 的制备：研究人员通过2G与不同量 Man-Phe 反应获得 D.S.1 与 D.S.2 两种产物；核磁显示每个 α-CD 分别引入约1个和2个甘露糖，同时 DET 单元数分别为4和3.5，说明甘露糖取代会影响胺化度。
3.2 Man-Phe-2G/OVA 的理化性质：Man-Phe-2G 与 OVA 简单混合即可形成纳米级复合物，复合物呈正ζ电位；在 pH 5.5 时ζ电位高于 pH 7.4，提示 DET 在内体酸性环境下由一价阳离子转为二价阳离子，支持内体逃逸。
3.3 Man-Phe-2G/OVA 的细胞摄取：BMDC 高表达 CD206；Man-Phe-2G/OVA 摄取显著高于 OVA 单独与 2G/OVA，且 D.S.2 高于 D.S.1；甘露聚糖可浓度依赖地抑制摄取，证明摄取由 CD206 介导；聚轮烷上可移动的甘露糖可适配受体分布，从而增强识别与内吞。
3.4 Man-Phe-2G/OVA 的 DC 成熟诱导能力：Man-Phe-2G/OVA 显著提升 MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86 表达，且随甘露糖取代度增加更明显，说明抗原摄取增加可转化为更强 APC 成熟信号。
3.5 Man-Phe-2G/OVA 的炎症细胞因子产生：Man-Phe-2G/OVA 较 OVA 单独与 2G/OVA 诱导更多 IL-12；体内免疫后脾细胞经 OVA 肽刺激产生更高 IFN-γ，表明其可活化 CD4+ 与 CD8+ T 细胞。
3.6 Man-Phe-2G/OVA 的抗体诱导能力：皮下免疫小鼠后，Man-Phe-2G/OVA 抗OVA IgG 显著高于 OVA 单独；D.S.2/OVA 优于 2G/OVA 与 D.S.1/OVA，说明甘露糖密度与氨基数之间存在最优平衡。
3.7 Man-Phe-2G/OVA 的安全性：RAW264.7 细胞毒性可忽略；小鼠两次皮下给药后乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE) 与 PBS 组相当，提示系统安全性良好。
讨论部分总结：研究人员指出，Man-Phe-2G 借助可移动甘露糖适配 CD206 分布，实现 APC 选择性摄取，并结合 2G 的内体逃逸能力保护 OVA 并增强免疫原性。D.S.2 虽氨基略少，但更高甘露糖密度带来更强受体识别，说明载体性能由靶向配体密度与核酸/蛋白结合用阳离子基团数量共同决定。未来需构建更多取代度组合以确定最优结构，并补充固定配体对照以验证“配体移动性”优势。
结论部分翻译：总之，Man-Phe-2G 可与 OVA 相互作用并将 OVA 高效递送至树突状细胞。特别是甘露糖的存在使抗原通过甘露糖受体递送，从而产生强于未修饰甘露糖的 2G 的免疫原性。研究人员此前已证明用 N-乙酰半乳糖胺(GalNAc) 修饰聚轮烷中的 CD 可使 GalNAc 具有移动性，从而较葡聚糖固定 GalNAc 对照大幅提高肝细胞识别；后续应对 Man-Phe-2G 开展类似固定配体对照研究。这些结果表明 Man-Phe-2G 具有作为蛋白疫苗载体的潜力，可为蛋白抗原疫苗开发提供重要参考。
