钠离子响应性可注射超分子水凝胶递送工程化沙门氏菌以实现更安全且增强的肿瘤免疫治疗

《The Innovation》：Sodium-ion-responsive injectable supramolecular hydrogel delivers engineered Salmonella for safer and enhanced tumor immunotherapy

　　

基于减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009（VNP）的活菌药物（live bacterial therapeutics, LBTs）在难治性癌症治疗中展现出巨大前景。然而，抗肿瘤疗效的提升往往伴随着全身毒性的增加。为应对实现强效与可接受安全性这一关键挑战，该研究开发了一种适用于VNP递送的钠离子响应性可注射超分子水凝胶——异甜菊醇-1,6-二酯磺酸钠（isosteviol-1,6-diester sodium sulfonate, 1,6-DAS）。通过将工程化VNP（表达TNF-α纳米抗体[nb]的VNP，VNP-TNF-α nb）包封于该水凝胶中，并在小鼠黑色素瘤模型中进行腹腔递送，不仅减轻了78.8%的细菌诱导的体重下降，完全预防了VNP相关的肝脾肿大、坏死、组织损伤和免疫失调，还进一步增强了抗肿瘤免疫应答。研究结果表明，1,6-DAS水凝胶通过双重机制实现VNP的全面减毒：缓释降低了肝脏和脾脏中的急性细菌负荷，同时1,6-DAS分子与VNP鞭毛蛋白结合减弱了其免疫原性。此外，通过1,6-DAS水凝胶递送VNP-TNF-α nb，通过上调和激活肿瘤微环境中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）和CD8⁺ T细胞，进一步增强抗肿瘤免疫。总之，1,6-DAS水凝胶为解决基于VNP的疗法中平衡疗效与安全性这一核心挑战提供了一种有前景的策略，具有推动微生物组驱动的癌症免疫治疗发展的巨大潜力。

癌症仍是全球范围内导致死亡的主要原因之一。2022年全球约新发癌症2000万例，导致约970万例死亡；预计到2050年全球癌症负担将增加77%，每年新发病例超过3500万例。活菌药物（live bacterial therapeutics, LBTs）作为一种前沿抗癌策略受到广泛关注，其中减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009（VNP）是研究最深入、临床转化前景最明确的候选菌株。然而，VNP的临床开发长期面临一个根本性矛盾：提高抗肿瘤活性往往伴随毒性增加，而降低毒性又会削弱疗效。尽管通过基因工程使VNP递送PD-1或TNF-α纳米抗体（nanobody, nb）等蛋白药物可在一定程度上增强靶向疗效，但工程菌在肝脏、脾脏等正常器官中的低水平定植仍会造成附加毒性和全身不良反应。因此，开发能在不牺牲疗效的前提下降低工程化VNP毒性的新策略，对推进基于VNP的LBTs至关重要。

水凝胶因其高含水量、良好生物相容性和可包载多种治疗剂而成为有前景的生物材料，但以往用于细菌递送的水凝胶多无法解决VNP功效与毒性相互耦合的问题。本研究基于天然甜味剂甜菊苷水解产物异甜菊醇，化学合成了低分子量超分子水凝胶前体——异甜菊醇-1,6-二酯磺酸（1,6-DA）。1,6-DA在接触体内的钠离子后，通过磺酸基与钠离子的离子交换快速原位自组装形成1,6-DAS水凝胶。由于腹腔中钠离子浓度足以触发该凝胶化过程，1,6-DA溶液可在腹腔注射后温和原位成胶，实现细菌的缓慢释放。研究人员将VNP及表达TNF-α纳米抗体的工程化VNP（VNP-TNF-α nb）包封于1,6-DAS水凝胶中，系统评估了其抗肿瘤疗效、安全性及作用机制。结果表明，该水凝胶平台在不削弱VNP抗肿瘤效果的前提下，显著降低了全身毒性，甚至增强了抗肿瘤免疫应答，首次实现了VNP疗效与毒性的完全解耦。

本研究主要涉及以下关键技术方法：通过化学合成制备1,6-DA并经质谱和核磁共振表征；采用分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟分析水凝胶自组装及分子间相互作用；利用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察凝胶微观结构；通过流式细胞术分析免疫细胞亚群；采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测抗体滴度；使用血常规与血清生化分析评估安全性；建立小鼠皮下黑色素瘤（B16F10）和Lewis肺癌（LLC）模型以及双侧肿瘤模型进行疗效评价；并按照PRISMA规范开展抗TNF-α抗体疗效的系统meta分析。动物实验使用6–8周龄、体重16–18 g的C57BL/6J雌性小鼠，购自常州卡文斯实验动物有限公司，于SPF条件下饲养。

研究结果如下：

**1,6-DAS水凝胶的合成与基本性质**：研究人员发现，1,6-DA在水溶液中加热溶解后冷却仍保持澄清，加入钠离子后迅速发生离子取代并自组装形成1,6-DAS水凝胶。MD模拟显示，氢键网络和钠离子配位共同驱动分子聚集成有序超分子结构。SEM图像显示该水凝胶由直径约50 nm的纳米纤维交织成带状网络，可有效包载细菌。

**钠离子响应性凝胶化性能及体内安全性评价**：流变学分析表明水凝胶具有良好弹性特征，10 mg/mL和20 mg/mL浓度下储能模量均高于损耗模量。在不同浓度NaCl（0.45%–1.8%）溶液中，10 mg/mL的1,6-DA均可在60秒内成胶，表明凝胶化对钠离子浓度具有稳健响应。腹腔注射后水凝胶均匀分布于腹腔脏器表面，并在24小时内基本降解吸收。溶血率检测、主要器官苏木精-伊红（H&E）染色和血生化分析均证实该水凝胶具有良好的体内生物相容性，无可见毒性。

**VNP的包封与缓释评价**：1,6-DAS水凝胶对VNP的负载量超过1×10⁹菌落形成单位（colony-forming units, CFU），显著高于1×10⁶ CFU的常规治疗剂量。SEM显示包封后VNP形态完整，活力未受明显影响。体外释放实验表明，在模拟动物活动的100 rpm摇动条件下，水凝胶在72小时内释放约80%细菌，而静置条件下无明显释放。体内分布结果显示，1,6-DAS/VNP组在给药24小时时肿瘤内VNP滴度低于游离VNP组，但72小时时回升至相当水平；同时脾脏VNP负荷有所降低，且不削弱肿瘤靶向定植能力。

**1,6-DAS/VNP在黑色素瘤模型中的抗肿瘤疗效与安全性**：在B16F10皮下肿瘤模型中，1,6-DAS/VNP的肿瘤抑制效果与游离VNP相当，但体重下降改善了82.0%（平均下降由4.40 g降至0.79 g），第20天存活率从67%提高至100%。组织学和脏器指数分析显示，1,6-DAS几乎完全逆转了VNP诱导的肝脾肿大和组织损伤。血常规和血清生化检测进一步表明，1,6-DAS有效改善了VNP引起的谷丙转氨酶（ALT）升高及白细胞（WBC）和血小板（PLT）减少。

**1,6-DAS介导VNP减毒增效的机制**：SEM和zeta电位分析显示，水凝胶降解释放后的VNP表面残留有1,6-DAS薄层涂层，且表面电位显著降低。MD模拟表明，1,6-DAS分子与VNP鞭毛蛋白的D0和D1结构域具有强结合能力（最低结合能分别为?7.96 kcal/mol和?7.83 kcal/mol），可形成物理屏障掩盖鞭毛蛋白的免疫原性表位。炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平在1,6-DAS/VNP组与PBS组无显著差异，沙门氏菌特异性抗体滴度也显著降低。流式细胞术显示，1,6-DAS/VNP逆转了VNP引起的脾脏免疫细胞比例紊乱，并增加了肿瘤内树突状细胞（DCs）比例，而CD8⁺ T细胞比例未受不利影响。进一步MD模拟提示，1,6-DAS可与DC膜上钠通道蛋白Nav1.7稳定结合，可能维持通道开放构象，增强钠离子内流，从而促进DC活化和抗原提呈。

**1,6-DAS/VNP在皮下LLC肿瘤模型中的抗肿瘤疗效与安全性**：在LLC模型中，1,6-DAS/VNP同样保持了与游离VNP相当的肿瘤抑制作用，同时显著减轻体重下降，完全逆转肝脾肿大和组织损伤，并使ALT、WBC、PLT等指标恢复正常，证明该减毒增效策略具有跨肿瘤类型的普适性。

**抗TNF-α抗体抗肿瘤疗效的系统meta分析**：按照PRISMA规范，研究人员对5项符合标准的临床研究进行meta分析，结果显示抗TNF-α抗体治疗的客观部分缓解（PR）率仅为10%，疾病进展（PD）率为49%，疾病稳定（SD）率为29%。meta回归分析发现，≥3级严重不良事件的发生是影响PR率的最显著负面因素；当超过40%的患者出现严重不良事件时，PR率降至3%，而低于40%时PR率升至25%。这表明严重不良反应是限制抗TNF-α抗体肿瘤治疗疗效的关键瓶颈，也解释了为何单纯系统给予抗TNF-α抗体难以成功。

**1,6-DAS/VNP-TNF-α nb在黑色素瘤模型中的抗肿瘤疗效与安全性**：VNP-TNF-α nb本身具有更强疗效但毒性也更突出。封装于1,6-DAS水凝胶后，1,6-DAS/VNP-TNF-α nb保留了VNP-TNF-α nb的优越抑瘤效果，并使细菌诱导的体重下降减轻78.8%（平均下降由5.47 g降至1.16 g）。脾脏和肝脏毒性几乎完全消失，与PBS组无显著差异。免疫分析显示，1,6-DAS/VNP-TNF-α nb处理不仅增加了肿瘤内DC（包括CD86⁺和MHC-II⁺亚群）比例，还显著提高了肿瘤和血液中CD8⁺ T细胞比例。在双侧肿瘤模型中，1,6-DAS/VNP-TNF-α nb处理使对侧（未注射侧）肿瘤无瘤生存率达到4/5，而游离VNP-TNF-α nb组仅为1/5，表明该策略显著增强了抗肿瘤系统免疫应答。

在讨论部分，研究人员指出，1,6-DAS是一种基于钠离子响应的低分子量超分子水凝胶，相比于传统聚合物水凝胶，具有可注射性强、载菌量高、室温包封不损伤细菌等优势，且能够实现腹腔内原位缓释。该平台首次实现了VNP类LBTs的疗效与毒性解耦，打破了“增效必然增毒”的传统范式。研究人员还强调，严重不良事件是抗TNF-α抗体临床疗效受限的主要因素，而1,6-DAS通过缓释降低肝脾急性细菌负荷和物理屏蔽鞭毛蛋白免疫原性，有效解决了这一问题。此外，1,6-DAS可能通过与DC表面钠通道蛋白相互作用增强DC功能，从而提升肿瘤抗原提呈和T细胞激活。研究人员也承认，目前尚缺乏直接证据证明1,6-DAS分子随复合物递送至肿瘤微环境，且尚未找到可用于活体荧光示踪的标记物，这有待未来研究完善。

结论部分指出：该研究建立了一种新型钠离子响应性原位自组装1,6-DAS水凝胶，作为递送工程化VNP细菌的安全有效平台。1,6-DAS水凝胶显著减少肝脏和脾脏中的短期细菌负荷，并在VNP鞭毛蛋白免疫原性区域形成物理屏障，从而有效解耦高抗肿瘤疗效与全身毒性。同时，水凝胶介导的缓释显著增加了肿瘤内DC和CD8⁺ T细胞浸润，而1,6-DAS分子还通过与DC表面VNP上调的钠离子通道蛋白直接相互作用，进一步增强DC介导的抗肿瘤免疫应答。这些发现不仅克服了细菌介导癌症治疗的关键限制，也为肿瘤治疗中的免疫调节优化开辟了新途径，推动了工程化LBTs的发展。该研究发表在《The Innovation》上，为基于微生物组的癌症免疫治疗提供了重要理论依据和转化潜力。