《Cell Biomaterials》：Approaches for recapitulating the extracellular matrix in organs-on-chip
器官芯片技术通过提供与人体相关的模型来加速药物开发，同时减少对动物研究的依赖，正在重塑生物医学研究。然而，尽管在微加工和多细胞组织工程方面取得了显著进展，细胞外基质（ECM）仍然是这些系统中再现程度最低的方面之一。重建天然组织微环境需要设计一种动态材料，在该材料中，基质组成、力学特性和流体介导的信号共同作用以指导细胞行为。本综述总结了在器官芯片系统中重建ECM的最新进展，并认为下一代器官芯片平台的定义将不再仅仅依赖于增加结构复杂性，而是取决于其将具有生物学指导意义的ECM与可制造的生物材料系统相结合的能力。研究人员综合了涵盖天然和合成水凝胶、脱细胞基质、复合生物材料和光交联平台的进展，同时强调了间质流和可溶性基质相关因子在建立组织功能中的补充作用。研究人员没有将这些材料类别视为相互竞争的解决方案，而是提出了一个框架，用于确定在特定应用中何时应优先考虑生物学保真度、可调性、可重复性或可扩展性。
引言和综述范围
近期美国联邦层面和全球范围内减少临床前研究中动物使用的努力，加速了对动物试验新型替代方法（NAMs）的兴趣，其中包括器官芯片（OoC）技术。这些平台旨在重现组织级别的结构和不同程度的器官级别功能，已有众多综述聚焦于其细胞组分或制造物理装置所需的微流控和加工方法。重要的是，为实现组织结构或器官级功能，所得平台必须在某种程度上重现天然的3D细胞微环境，并且任何微流控或结构性装置组件都必须由生物相容性材料制成、涂覆或包含此类材料。尽管微流控技术和驻留细胞类型的复杂性日益增加，用作细胞外基质（ECM）模拟物的材料子集仍然相对有限。在此，研究人员回顾了在OoC开发中用于重建ECM的材料，重点关注近5年内发表的论文。许多这类材料已在组织工程和3D细胞培养工作中使用了数十年，研究人员引导读者参阅那些详细阐述材料生化组成、体内生物相容性和来源的综述，而在此则专门关注它们在OoC中的应用。
为界定综述范围，研究人员将OoC定义为经过合理设计的系统，该系统将细胞包埋于或接种在模拟天然ECM的生物材料之上或之中，并实现了传统细胞培养中未曾观察到的结构和/或多细胞功能。大多数此类研究都包含某种微流控装置，并讨论了ECM材料与构成物理OoC结构的微流控系统和合成聚合物的兼容性。由于OoC研究中使用的材料子集相对有限，多数材料已被用于模拟不止一种组织。在这些情况下，组织特异性通常源于尝试将模拟材料的力学特性与被建模组织的天然力学和/或传输特性相匹配。为建立比较和对比OoC开发中所用材料的参数空间，研究人员首先回顾并定义了在构建OoC中常用作设计参数的关键生物材料属性。
OoC中ECM的设计考量
天然微环境向驻留细胞呈现了多种生化和生物物理信号，数十年来在开发用于组织工程的3D水凝胶方面的研究一直致力于将这些信号参数化，并为在体外重建天然ECM特性确立设计参数。虽然这些参数仍是关键的设计标准，但OoC的构建通常涉及将ECM材料封装在封闭结构中，这引入了额外的设计参数，包括预凝胶浆料的粘度、水凝胶的力学特性和溶胀特性，这些对于将这些材料整合到微流控装置中至关重要。在此，研究人员在提供每种用于构建OoC的材料的具体实例之前，先简要回顾这些关键设计标准。
凝胶动力学
对于旨在模拟机械受限系统（如微流控装置和OoC）内ECM的水凝胶而言，考虑凝胶动力学至关重要。对于可注射水凝胶，预凝胶浆料必须保持足够低的粘度和延迟的凝胶化，以便均匀填充封闭几何形状，而不会过早堵塞或形成气泡。相反，凝胶化必须在原位快速且可靠地进行，以防止材料流失至灌注通道、细胞因重力沉降或被周围流体稀释。因此，可注射性与凝胶化之间的窗口直接限制了OoC的工作流程、细胞装载策略和细胞的空间模式化。在本综述中，研究人员将凝胶化定义为从粘性流体到粘弹性或弹性固体的状态转变，参数化为储能模量超过损耗模量。在方法上，凝胶化是通过对热力学环境进行时间依赖性操作，或通过促进聚合物主链链段间的离子键或共价键来实现的。单个交联的可逆性和机械强度以及所得水凝胶的涌现力学特性取决于这些交联的性质。物理交联较弱且可逆，源于离子键、疏水相互作用或聚合物缠结，而化学交联涉及更强且不可逆的共价键。此外，快速凝胶化可能在动力学上捕获非平衡聚合物网络，影响孔隙率和粘弹性力学性能，而较慢的凝胶化则允许聚合物重组和细胞沉降。因此，主链材料的选择以及用于修饰或交联主链聚合物链的化学方法在OoC的开发中至关重要。
力学和粘弹性性质
ECM的弹性和粘弹性力学特性是OoC平台中细胞行为的核心调节因子，影响着细胞的粘附、迁移、分化、屏障功能和细胞命运。天然组织不仅表现出组织特异性的弹性力学特性，还具有时间依赖性的行为，包括应力松弛、蠕变和多孔弹性流体流动，这些源于其水合、纤维状和动态重塑的结构。OoC系统越来越多地旨在重现这些特性，ECM设计已从针对单一生理刚度转向调控一个多维度的力学景观，包括弹性模量、损耗模量、应力松弛时间尺度和水力渗透率，所有这些都由聚合物架构、交联化学和水合作用所塑造。重要的是，文献中报道的ECM刚度值差异很大，因为它们强烈依赖于测量方式、加载模式和时标。体相技术如剪切流变学报告了小振幅振荡剪切下的储能模量和损耗模量，探测了与组织级别变形相关的介观尺度力学。拉伸或无侧限压缩测试进一步探测了不同的变形模式，这些模式在封闭的OoC几何结构中很少被细胞遇到，但在肌肉骨骼组织等组织尺度载荷的背景下可能相关。相比之下，基于压痕的方法，包括原子力显微镜和纳米压痕，以确定的速率和深度施加局部压缩载荷，产生表观模量，该模量对探针几何形状、应变率和多孔弹性流体渗出敏感。因此，通过不同方法获得的刚度值不能直接互换，如果不仔细考虑加载几何形状、应变幅度、速率和边界条件，跨研究的比较通常是无效的。为解释这种变异性，研究人员在报告本综述中的力学特性时会提供测量方式的信息。
孔径和水凝胶微观结构
除了弹性和粘弹性特性之外，交联的方法和程度从根本上调节着水凝胶的孔隙结构，对OoC平台中细胞感知的生化和生物物理信号具有重要的下游影响。在聚合物水凝胶中，通过更高的聚合物浓度、增加的官能团取代度或更大程度的离子、酶促或光引发交联来增加交联密度，会减小网络的有效网孔尺寸并缩小孔径分布。孔隙结构的这些变化直接影响通过基质的质量传递，包括对间质液流动的水力传导率、可溶性因子的有效扩散系数以及大分子、生长因子和细胞外囊泡的空间位阻可达性。因此，孔径通过塑造形态发生素和细胞因子的梯度、控制营养物和废物交换速率，以及通过空间位阻限制细胞突起、铺展和迁移，充当细胞行为的独立调节因子。重要的是，虽然孔径通常与体相刚度相关，但它并非唯一由刚度决定。不同的交联化学可以产生具有相似弹性模量但不同传输特性的材料。在封闭的OoC几何结构中，间质流和灌注是常见的，这些孔隙尺度的传输效应会影响细胞所经历的局部力学和生化微环境。因此，OoC的理性ECM设计需要考虑孔隙结构和传输参数，与传统的力学指标并行，特别是在模拟对流、扩散或空间限制在调节生理或疾病进展中起核心作用的组织时。虽然ECM微观结构的功能性后果可以用水力传导率、有效扩散系数或网络结构来参数化，但由于能够从材料的电子显微镜图像中测量孔径，孔径是水凝胶文献中最常报告的指标，因此可作为比较不同OoC平台微观结构的实用设计参数。然而，单独的孔径并不能完全描述基质传输和细胞-基质相互作用，因为它不能完全捕捉孔隙连通性、空间异质性、各向异性或在封闭OoC环境中最终控制水力渗透率、溶质运输和细胞尺度机械传感的耦合流体-固体动力学。
细胞粘附位点和基质结合的生化信号
细胞粘附位点和基质结合的生化信号是OoC平台中细胞行为的关键决定因素，因为它们控制着细胞如何感知、粘附和重塑周围的ECM。天然ECM呈现出整合素结合基序，包括肽序列RGD、GFOGER和/或YIGSR、蛋白酶可切割位点以及以时空受控方式固定的生长因子，从而实现动态的细胞-基质互惠。在OoC装置中，这些信号的不足或非生理性呈递可能导致异常的细胞形态、受损的极化或屏障功能以及组织特异性表型的丧失，即使体相力学特性与天然组织匹配良好。因此，OoC中的ECM设计越来越认识到基质化学与力学是不可分割的，特别是在需要持续信号传导和细胞驱动重塑的长期或灌注培养中。为满足这些要求，OoC平台采用了一系列策略来以可控的特异性和密度工程化粘附和基质结合信号。天然来源的ECM，包括I型胶原、纤维蛋白、脱细胞ECM和Matrigel，本质上提供了多样的粘附基序和酶促降解序列，尽管其可调性和可重复性有限。相比之下，合成和化学改性的水凝胶，包括聚乙二醇、葡聚糖和甲基丙烯酸化天然聚合物，将力学控制与生化信号解耦，并可功能化以添加定义的粘附肽、基质金属蛋白酶可切割连接体或固定的生长因子，以恢复生物活性。复合和混合水凝胶结合了这些方法，允许天然ECM成分提供生物复杂性，而合成骨架提供结构和制造控制。重要的是，有效的OoC ECM材料必须被设计成既能支持初始细胞附着，又能在整个装置的寿命期间维持动态的、组织适当的信号传导。下文描述了ECM生物化学已被工程化以改善组织模拟性的实例。
可制造性、可重复性和可扩展性
随着OoC平台从概念验证装置向药物开发、安全性测试和监管决策的应用过渡，可制造性、可重复性和可扩展性正成为ECM材料日益关键的设计考量。为了获得FDA等机构的监管认可，OoC系统必须在批次、地点和操作者之间展示一致的性能，并具有明确定义和可追溯的材料输入及制造工作流程。ECM组成或力学特性的变异会引入不受控制的实验噪声，掩盖生物学读数，并削弱对其预测有效性的信心。此外，可扩展的制造对于支持多芯片研究、纵向测试和实验室间验证至关重要。不同的ECM材料类别沿着这些设计轴呈现出不同的优势和局限性。天然来源的水凝胶和dECM提供了高生物学相关性，但存在批次间变异、供体或组织依赖性以及对力学特性控制有限的问题，所有这些都挑战了标准化和放大。dECM和细胞来源基质提供了无与伦比的组成复杂性，但在采购、处理时间、产量和监管可追溯性方面面临额外障碍。相比之下，合成聚合物和化学改性材料提供了卓越的可重复性、可调的力学特性以及与自动化制造和微流控集成的兼容性。这些材料更适用于良好生产规范工作流程，但需要有意的生物功能化或复合设计。复合ECM系统越来越多地寻求通过将生物复杂组分与赋予力学控制和制造稳健性的合成骨架相结合来平衡这些权衡。总体而言，实现符合监管要求的OoC平台需要仔细协调ECM材料选择与生物学保真度、工艺标准化和可扩展性，从而将ECM设计定位为一个不仅是生物学问题，也是制造和转化问题。虽然这些制造方面的考量很难从概念验证实验中推断出来，但研究人员在下文讨论每种材料类别时都会比较和对比其对放大的适应性。
天然聚合物水凝胶
由天然聚合物形成的水凝胶，包括海藻酸盐、纤维蛋白、I型胶原和Matrigel，已成为大多数OoC装置中ECM的基础。每种材料在配体可用性、可降解性和力学特性方面各有优缺点，因此它们越来越多地被用作复合水凝胶的组分，以更好地重现天然组织的复杂性。在此，研究人员简要回顾了每种材料，并提供了它们在OoC开发中的近期应用实例，以为下文讨论的更复杂的复合材料提供背景。
海藻酸盐
海藻酸盐是一种阴离子多糖，其β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸残基嵌段决定了海藻酸盐水凝胶的物理性质，如体相弹性模量和孔隙率。由于其生物相容性、凝胶动力学和可调的力学特性，海藻酸盐被广泛用于OoC和组织工程。海藻酸盐水凝胶的凝胶化是由多价阳离子与海藻酸钠聚合物链的离子交联驱动的，并且可以通过调整海藻酸盐浓度、分子量和钙离子浓度来调节其力学特性。然而，海藻酸盐缺乏细胞内在的粘附位点，通常需要用RGD进行修饰以促进细胞附着和信号传导。由于需要修饰海藻酸盐以促进粘附和/或可降解性，它最常用于含有另一种具有生物活性部分的聚合物的复合水凝胶中。近期研究表明，通过调整海藻酸盐的分子量，所得水凝胶的粘弹性特性可以独立于弹性力学特性进行调节。RGD功能化海藻酸盐的粘弹性特性，通过AFM压痕响应中的应力松弛测量，控制了肾脏类器官中肾单位的空间分布和模式化。随着ECM粘弹性被越来越多地理解为天然微环境的关键组成部分，工程化海藻酸盐粘弹性力学特性的能力将成为进一步发展OoC的有用工具。
纤维蛋白
纤维蛋白原是一种由肝脏产生的可溶性血浆糖蛋白，存在于循环血液中。在体内，凝血酶蛋白酶从纤维蛋白原上切割下纤维蛋白肽，催化其聚合成纤维蛋白网。在体外，凝血酶和纤维蛋白原可以以不同的化学计量比混合，快速形成3D水凝胶网，可用于包封细胞或作为2D底物。纤维蛋白原转化过程中的相对凝血酶浓度决定了水凝胶结构，低凝血酶浓度产生粗的、高度渗透的纤维蛋白原纤维，而较高的凝血酶浓度产生更细的原纤维和渗透性较低的致密网络。除了天然呈现包括RGD在内的粘附配体外，纤维蛋白很容易被细胞分泌的蛋白酶降解，这允许细胞介导的对水凝胶的动态重塑，但这些水凝胶的快速降解为纵向研究提供了有限的动态范围。由于其在止血和伤口愈合中的作用，纤维蛋白已被用于几种血管系统的微生理系统。纤维蛋白水凝胶已被用于建立可灌注的微血管网络，利用外周血血浆中的内源性纤维蛋白原和凝血酶，重现血管内血栓形成，以研究肿瘤细胞外渗中的凝块动力学。利用纤维蛋白的类似方法也已扩展到在微流控装置中开发可灌注的血球体，表明在流动条件下的球体更紧密地模拟天然微血管系统，具有更高数量的连接、网格、片段和总网络长度。为增强纵向稳定性，明胶-纤维蛋白复合水凝胶已被用于开发肾脏芯片模型，其中纤维蛋白含量促进了内源性微血管网络的形成，并促进了类器官融合以创建可灌注的肾脏类器官。在这些研究中，纤维蛋白已成为复合系统中的关键工具，用于驱动血管化和促进OoC平台内动态组织中的细胞重塑。
I型胶原
I型胶原是天然ECM中最丰富的胶原亚型，已从人和动物来源获取用于OoC。虽然在乙酸中溶解的I型胶原可以自组装并通过物理交联形成水凝胶，但其力学特性可通过化学修饰进一步调节。I型胶原因其天然存在的细胞结合位点、MMP可切割序列以及既可用作涂层也可用作水凝胶的能力而被广泛应用于OoC构建，一篇近期综述总结了将I型胶原整合到OoC中的方法。由于I型胶原水凝胶具有明确的力学特性和相对较大的孔径，它越来越多地被用于补充脱细胞组织，以在保持生理相关力学特性的同时重现天然ECM组成的多样性，如下文所述。
Matrigel
Matrigel是一种源自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤的基底膜提取物，含有其他天然水凝胶中不存在的ECM蛋白，包括层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白和串珠素。这些基底膜蛋白以及巢蛋白介导的胶原和层粘连蛋白在22°C-37°C之间的物理交联，使得Matrigel被用作上皮和内皮细胞的底物，并广泛用于类器官开发。然而，Matrigel受到高批次间变异、异种污染物以及形成高度顺应性水凝胶的限制。尽管有这些缺点，Matrigel对于OoC和类器官芯片平台仍然必不可少。最近的视网膜芯片模型将Matrigel整合到微流控装置中以调节流体剪切应力和氧浓度，增强了视网膜祖细胞池，协调了视网膜神经节细胞的特化，并促进了轴突生长，而不干扰早期阶段的时间和空间模式化事件。在肺部模型中，Matrigel促进了上皮分层，阐明了巨噬细胞在博来霉素诱导的纤维化中的作用。Matrigel的物理交联支持了肝类器官在25天内的分化和功能。尽管Matrigel高度可变，最近一项研究报告其通过AFM测量的弹性模量变异超过50%，但在OoC模型中重现基底膜的替代方案仍然有限。为改善Matrigel基水凝胶的机械完整性和增加弹性力学特性，已经开发了几种复合水凝胶。将脑胚体包埋在Matrigel中并包裹在一层薄薄的海藻酸盐中，导致了温和且瞬时的细胞产生的压缩力，促进了神经元标志物的表达并增强了成熟。用CaSO4交联的海藻酸盐-Matrigel复合材料允许制备更硬的水凝胶，用于开发骨髓模型。纤维蛋白-Matrigel复合水凝胶改善了心肌病的体外心脏OoC模型，能够更可靠地测量胶原沉积，而I型胶原-Matrigel复合材料已被证明可以支持血管血类器官的形成。虽然这些方法解决了Matrigel的力学缺陷，但与未定义组成和生化变异相关的挑战仍然是临床前标准化和放大的重大障碍。
天然聚合物小结
天然ECM衍生材料，包括海藻酸盐、纤维蛋白、I型胶原和Matrigel，仍然是OoC平台的基础组分，因为它们提供了难以通过合成方法复制的细胞交互特征。每种材料都有独特的优势：海藻酸盐提供广泛的力学可调性和制造控制，但缺乏内在的粘附和可降解性；纤维蛋白能够实现快速的细胞介导重塑，但在长时间培养中机械不稳定；I型胶原呈现天然的粘附位点和纤维状结构，但在没有二次交联的情况下力学范围有限；Matrigel提供了无与伦比的基底膜样生化复杂性，但存在批次变异、异种来源和持续顺应的力学特性。因此，没有一种单一的天然材料能同时实现生化保真度、独立的力学控制和可重复性。这些局限性推动该领域走向材料改性和混合策略，即在保留细胞-基质相互作用的同时，改善对刚度、粘弹性和制造工作流程的控制。
甲基丙烯酸化天然聚合物
为提供对天然水凝胶凝胶化和力学特性的改进时空控制，已开发了几种方法，涉及用甲基丙烯酸酯或其他化学修饰剂修饰天然主链，以使材料在暴露于紫外或可见光时能够交联。所得材料仍然受到刚度-孔径和刚度-脆性权衡的影响，但仍允许重现更广泛的生理力学特性，包括报道的在MPa范围内的弹性模量。
GelMA
明胶甲基丙烯酰酯已成为一种通用的改性天然聚合物，用于组织工程和OoC应用。GelMA源自明胶，明胶是通过部分水解天然I型胶原产生的，并由于与I型胶原相反的凝胶特性，长期以来一直被用作OoC模型中的牺牲材料。最常用的明胶源材料是猪皮，但也探索了鱼皮，以解决可能妨碍猪组织在转化应用中的文化和宗教考量。GelMA的一个优势源于其合成：通过使明胶与甲基丙烯酸酐反应以功能化明胶主链，保留了天然明胶中存在的细胞粘附肽和MMP易感基团，同时在光引发剂存在下引入了光诱导共价交联的可能性。通过调整明胶和光引发剂的质量浓度以及光能量剂量，与I型胶原相比，GelMA可以实现更广泛的力学特性谱，这使得可以根据天然力学特性对不同组织进行建模。生物复杂性和力学可调性的结合使得GelMA能够比2D细胞培养更长时间地支持组织特异性细胞表型，正如在人源化脂肪、肝脏和骨模型中所证明的那样。GelMA的力学可调性允许OoC装置的多步骤组装，从而实现难以仅用天然水凝胶制造的生理结构。例如，一个课题组最近使用钙交联的海藻酸盐微珠形成密堆积立方晶格来重现肺泡结构，同时加入源自猪皮的GelMA预凝胶以填充空隙空间。然后对GelMA进行光交联，再用微生物转谷氨酰胺酶再次交联，形成具有海藻酸盐珠反向图案的水凝胶。然后通过用EDTA螯合钙从系统中去除海藻酸盐，之后接种原代人肺泡上皮细胞。为模拟与呼吸相关的机械应变和流体流动，使用计算机控制的负压气动泵对接种后的肺泡结构两侧腔室进行循环加载，以驱动0.3Hz下10%的应变。机械应变导致空气流入和流出肺泡结构，平均速度大小重现了人肺泡流动。所得模型显示，与2D和PDMS对照相比，与ECM-受体相互作用和TNF-α信号传导相关的基因上调。正如这项工作所示，光交联GelMA的能力对于构建OoC很有吸引力，因为微流控装置被设计为光学透明的，从而允许在封闭环境中原位交联GelMA。光交联提供的时空分辨率促进了先进的制造技术，如体积生物打印和DLP打印。这一优势在一项近期研究中得到体现，该研究使用体积生物打印技术在光引发剂和碘克沙醇存在下，对载有肝类器官的GelMA进行光交联，以调节预凝胶浆料的折射率。该课题组创建了允许主动灌注以优化营养交换的晶格结构，并发现与静态培养下的类器官相比，在流动条件下培养于GelMA晶格中的类器官能更有效地过滤外源性氨。类似方法已被用于通过基于DLP的打印方法使组织血管化。尽管时空可控交联带来了优势，但明胶主链会发生基于温度的物理交联，GelMA的转变温度在20°C和24°C之间。当GelMA经历物理交联时，化学修饰基团的缠结限制了这些基团用于光交联的可用性，这可能导致在生理温度下交联GelMA的力学特性受损。
基于HA的水凝胶
透明质酸是一种高分子量的非硫酸化糖胺聚糖，存在于细胞微环境的固相和液相中，并已在再生医学和组织工程应用中用于提供结构支持、增加流体粘度和作为体内润滑剂。虽然是天然存在的，但HA缺乏天然的细胞粘附基序，必须进行修饰或与其他材料结合以支持细胞粘附。然而，主链中羧基、羟基和酰胺基团的可用性使得可以进行生化修饰。通过使HA与甲基丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸酐反应形成GMHA或HAMA，可以调节HA的力学特性。这些修饰提供了显著的优势，通过改变聚合物密度、光引发剂浓度和光照剂量，提供了粘弹性力学特性的动态范围。这使得能够操纵弹性模量以指导干细胞分化为肝、心、脑和骨谱系。HAMA的多功能性使其适用于干细胞研究和复杂组织建模。近期工作使用HAMA和鱼明胶生成含有hiPSCs的核壳微球，促使形成胚状体，这些胚状体沿肝、心和脑谱系分化，并表现出不同程度的器官级别功能。器官级功能通过脑类器官中神经元标志物SOX2和Nestin的表达、心脏类器官中的机械搏动和钙活性以及肝类器官中的白蛋白和尿素分泌进行评估。HAMA的这一应用提供了室温凝胶化的优势，这在GelMA中是不可能的，并在5秒内完成光交联，提高了所得胚状体内的细胞活力。HAMA经常被用来满足特定的组织需求，尤其是在组合方法中用以增强功能特性。例如，用磷酸钙水泥补充HAMA增强了水凝胶的骨传导能力，并促进了骨髓来源基质细胞的成骨分化。同样，一个课题组将磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯与HAMA整合，以改善软骨类器官培养中的亲水性、粘度和细胞粘附。虽然这些组合方法在个别组织中显示出前景，但所得水凝胶缺乏天然组织微环境的生化复杂性。
甲基丙烯酸化天然聚合物小结
甲基丙烯酸化天然聚合物在生物活性但力学受限的天然ECM与高度可调但生物惰性的合成材料之间占据了一个重要的中间地带。GelMA保留了其胶原衍生主链的许多粘附和蛋白水解降解基序，同时通过光聚合实现了对刚度和凝胶化的独立控制，使其特别适合空间图案化和微流控OoC制造。相比之下，HAMA提供了对粘弹性行为和应力松弛时间尺度的更广泛控制——这些参数越来越被认为对干细胞命运决定和组织成熟至关重要——但缺乏内在的细胞粘附位点，因此需要有意的生化功能化。因此，虽然甲基丙烯酸化天然聚合物显著扩展了OoC ECM材料的设计空间，但它们也推动了与合成聚合物和复合策略的进一步整合，以实现具有机械精度和持续生物功能的可扩展、可重复的基质。
来自脱细胞组织的异种水凝胶
脱细胞ECM代表了一种自上而下重建天然ECM的方法，其中动物组织被脱细胞并进一步处理以允许液化和可控凝胶化，从而提供无法通过单个组分的理性组装实现的生化复杂性。脱细胞对于避免所得材料的免疫原性至关重要。然而，在保留ECM大分子的同时优化脱细胞仍然具有挑战性，并且可能涉及物理、化学和/或酶促方法，具体取决于源组织。所得的dECM保留了组织特异性的胶原、层粘连蛋白、糖蛋白、糖胺聚糖、生长因子和其他生物活性ECM组分的化学计量。虽然dECM长期以来一直是研究细胞-ECM相互作用和组织组装的工具，但最近的进展涉及化学修饰或将其直接整合到装置或生物墨水中以实现可控凝胶化，从而允许开发具有复杂ECM组成的OoC。
异种dECM
近期研究证明了dECM在增加体外药物筛选的临床可转化性方面的潜力。例如，猪肝组织被脱细胞并引入微流控装置，接种HepG2肝癌细胞和L02健康肝细胞，以筛选靶向肿瘤细胞的纳米医学方法。dECM OoC模型中的细胞活力结果密切反映了小鼠模型的结果，但该研究缺乏对照来将预测性的体外结果专门归因于dECM。在肺癌模型中，在dECM涂层的微图案印章上形成球体，并筛选了暴露于各种癌症治疗药物时的活力。作者观察到，在响应阿霉素和顺铂时，球体和单层培养之间的细胞活力存在显著差异。这些研究的结果表明，dECM中保留的蛋白质允许构建反映天然ECM组成复杂性的OoC模型，但将dECM方法有效转化为OoC仍然具有挑战性。
甲基丙烯酸化异种dECM
尽管dECM的生化复杂性具有优势，但使用dECM水凝胶的一个主要挑战是，在消化和液化供体材料后，物理交联不足以恢复天然的力学特性。为通过外源性共价交联补充刚性，已开发了向溶解的dECM添加甲基丙烯酸酯基团的方法。一般方法包括在胃蛋白酶和盐酸中溶解之前对组织进行脱细胞和均质化。然后将甲基丙烯酸酐添加到溶解的组织ECM中，以在胺和羟基位点取代甲基丙烯酰基团，并通过透析去除过量的甲基丙烯酸酐。通过调节质量浓度和光剂量，所得水凝胶的特征在于压缩模量跨越10-40kPa，在无侧限压缩下测量，这与天然健康肝组织的数量级相当。类似方法最近应用于源自猪心脏和半月板的dECM。有趣的是，当比较来自牛、人和大鼠dECM的I型胶原的甲基丙烯酸化程度时，人胶原的甲基丙烯酸化程度与大鼠和牛来源相比有统计学上的显著增加。此外，光交联后测得的水凝胶压缩模量随物种而变化。虽然直接甲基丙烯酸化已被证明能有效产生重现天然力学特性的水凝胶，但对于甲基丙烯酸化的特异性以及甲基丙烯酰基团的取代或外源性交联是否调节dECM中细胞粘附或信号配体的可用性，仍存在问题。
改善异种dECM力学特性的替代方法
为在不化学修饰源材料的情况下共价交联dECM，已使用在钌/过硫酸钠光引发剂存在下的可见光照射来催化酪氨酸氧化和在dECM主链中形成共价二酪氨酸键。该技术已使用猪心脏和牛角膜进行了演示，这些组织经脱细胞、粉化、在胃蛋白酶和乙酸中消化，然后在Ru/SPS存在下暴露于可见光。与热介导的物理交联水凝胶相比，光交联的dECM水凝胶的特征在于压缩模量增加了>3倍。使用这些材料，重现了一定程度的器官级别功能，包括94%的光透射率和嵌入角膜dECM中的角膜细胞中角膜特异性基因的上调，以及心肌细胞负载的心脏dECM中的钙传播和搏动。虽然需要进一步研究来确定Ru/SPS介导的交联如何影响配体可用性，但这些结果表明了一种方法，通过该方法可以在OoC平台中重现复杂的ECM组成，而无需对主链进行化学修饰。提供可控交联并保持天然生化复杂性的另一种策略是将dECM与GelMA或HAMA结合，形成可通过光照进行化学交联或通过温度调节进行物理交联的复合水凝胶。发现肝dECM与牛I型胶原相比，促进了肝细胞更高的生物活性，在肝dECM构建体中，iPSC来源的肝细胞表现出E-钙粘蛋白和白蛋白的表达。为探索该技术的通用性，该课题组用牛心脏dECM补充了GelMA，得到的复合材料具有通过纳米压痕测量的跨越1.5-6.5kPa的杨氏模量值。重要的是，对于固定的光剂量，肝和心脏dECM水凝胶之间的杨氏模量存在统计学上的显著差异，表明源组织对复合材料力学特性的影响。与牛I型胶原对照相比，dECM环境中的iPSC来源的心肌细胞具有持续的高细胞活力，并表达了统计学上显著更高水平的心肌肌钙蛋白T，这是一种参与心肌收缩的心脏特异性蛋白。这些方法表明，复合水凝胶保留了dECM的生物活性，同时提供了对水凝胶力学特性的更高分辨率控制，但进一步表明组织来源至关重要。由于异质的ECM组成和与其他组织相比高度顺应的力学特性，重现大脑微环境是一个独特的挑战性问题。为在具有亚kPa弹性模量的水凝胶中保持天然组成并实现凝胶化，开发了一种涉及用HAMA补充脱细胞牛脑组织的复合方法，作为胶质母细胞瘤的体外模型。除了具有与胶质母细胞瘤测量值相似量级的顺应性弹性模量外，所得水凝胶还被定制以重现天然组织的高保水能力。与U87单培养或在仅HAMA水凝胶上的共培养相比，复合水凝胶中人U87胶质瘤和HMC3小胶质细胞共培养的侵袭距离增加了41%。该模型强调了对全面ECM模拟物的需求，该模拟物匹配天然环境的力学特性，并结合多培养方法，以最好地重现OoC模型中的天然微环境。
异种dECM小结
异种dECM提供了一种重现天然微环境生化复杂性和组织特异性信号的策略，保留了难以通过合成方法复制的多组分蛋白质组成、内源性粘附基序和基质结合信号。这些优势已在几个OoC模型中转化为改善的生物学相关性，包括肝和肺癌系统，其中dECM比单组分水凝胶更密切地反映天然的细胞-基质相互作用。然而，这些益处是以有限的力学可调性、显著的批次间和供体间变异性以及在脱细胞和消化后凝胶化稳健性方面的挑战为代价的。将dECM与力学支撑聚合物相结合的复合水凝胶部分缓解了这些局限性，改善了刚度控制和可加工性，但它们也重新引入了材料复杂性和变异性。
来自脱细胞组织的同种水凝胶
虽然脱细胞动物组织提供了增加的生化复杂性，但其在人OoC中的使用受到种间免疫原性差异以及物种依赖性ECM组成和结构的限制。例如，当比较来自人、灵长类、猪和大鼠供体的脱细胞肺组织时，在天然组织中观察到GAG、弹性蛋白和胶原含量在物种间的差异，并且这些差异在脱细胞后增加。类似地，对人、牛和猪来源的新鲜肝脏样本进行的单轴拉伸测试揭示了粘弹性力学特性的物种特异性差异。物种间的变异性促使了脱细胞人体组织的使用，其制备方法是通过改编已在动物组织上取得成功的方案。迄今为止，hdECM水凝胶已从多种人体组织中合成，包括膀胱、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、食道、半月板、神经和脂肪组织等。随着hdECM水凝胶提取技术的成熟，越来越多的努力致力于将这些材料与细胞重构，以构建人源化和患者特异性的OoC。
同种dECM
人类皮肤含有具有复杂且空间变化组成的ECM，这对从ECM材料的组合组装开发皮肤芯片模型提出了挑战。为应对这一挑战，从人类尸体上采集全层皮肤样本，进行脱细胞、冷冻干燥、并在胃蛋白酶和盐酸中消化。为通过物理交联促进凝胶化，将hdECM消化液的pH中和，并将消化液升温至37°C。所得水凝胶以与天然皮肤相似的浓度保留了弹性蛋白，以及其他蛋白质，包括I型、III型胶原、纤连蛋白和硫酸化GAGs。这种方法允许组装一个微流控装置，其中角质形成细胞被接种在成纤维细胞负载的皮肤hdECM水凝胶顶部，并通过微流控通道从基底表面灌注培养基。物理交联的真皮hdECM的特征在于约10Pa的剪切储能模量，显著比天然人皮肤更顺应，后者报道的弹性模量约为83.3MPa。
同种dECM的外源性交联
实现骨组织相对较高的刚度一直是骨OoC模型开发中的一个挑战。为提供对重构的人骨ECM的控制，一种近期方法从骨软骨/骨关节骨碎片中提取骨粉，然后对其进行脱矿、脱细胞、冷冻干燥，并用胃蛋白酶和盐酸消化。将甲基丙烯酸酐添加到骨基质溶液中以生成甲基丙烯酸化骨组织，然后在LAP存在下进行光交联。所得水凝胶的特征在于力学特性随光剂量变化，通过剪切流变学测量跨越约750-1500Pa的剪切模量。作者证明，凝胶化力学允许在聚合前注入PDMS装置，以制造骨芯片模型。与GelMA相比，接种在BoneMA中的内皮细胞延伸出更多类似于血管生成的细胞突起。虽然这种方法允许从人ECM合成3D水凝胶，但所得材料比相同质量密度和光交联参数下配制的GelMA更顺应，这引发了关于胃蛋白酶消化副产物的甲基丙烯酸化是否影响凝胶动力学、水凝胶微观结构和力学特性的问题。此外，用于溶解hdECM的胃蛋白酶是猪源性的，因此将异种组分引入到所得OoC中。
基于人细胞的方法
CDM代表了一种“自下而上”的方法，以在体外复制天然ECM的复杂性，并克服人体组织来源和供体组织变异性的挑战。CDM通常通过将成纤维细胞或其他产生基质的细胞培养数天，然后对沉积的基质进行脱细胞来生成。虽然这种方法提供了完全人源ECM的优势，并能实现疾病或患者特异性模型，但它仍然受到与2D培养相关的可扩展性、成本和低产量的限制。CDM可用作培养底物或加工成水凝胶，尽管CDM水凝胶的结构稳定性通常需要额外的材料。疾病特异性CDM已在模拟病理微环境方面显示出功能相关性。例如，结直肠癌CDM改变了HT-29和SW480细胞中的化疗耐药谱，突出了基质驱动的肿瘤进展调节。类似地，源自血管性埃勒斯-丹洛斯综合征的CDM表现出减小的纤维直径和刚度，损害了内皮细胞迁移。这项工作的一个关键观察结果是，来自患者供体的CDM以改变的粘弹性特性为特征，通过纳米压痕测量的应力松弛下更长的时常数来量化，这与通过CDM质谱测量的糖胺聚糖含量增加相关。这些结果证明了CDM复制病变ECM环境生化和生物物理信号的潜力，正如在糖尿病溃疡CDM中也观察到的，其显示出与健康对照不同的孔隙结构。将CDM整合到OoC中的一个挑战是人CDM片的厚度限制在约30μm，其用于3D细胞培养需要长时间的培养时间和支撑聚合物支架。一种近期方法通过遵循类似于上述为dECM开发的方案来处理CDM来解决这些局限性。人真皮成纤维细胞在补充有抗坏血酸的培养基中培养至汇合约一周，然后进行脱细胞、冷冻、粉化、在胃蛋白酶和盐酸中溶解，并冷冻干燥。重构的CDM预凝胶不能物理交联成水凝胶，需要补充大鼠尾来源的I型胶原、牛纤维蛋白或用京尼平进行化学交联以建立水凝胶，这些水凝胶保持了CDM中发现的大部分蛋白质。这些结果表明，将CDM整合到OoC可以提供一种增加装置中ECM复杂性的策略，同时提供比dECM方法更高程度的标准化。
同种dECM小结
同种hdECM通过保留人特异性ECM组成，包括天然细胞粘附基序、蛋白酶可切割序列和组织适当的蛋白质化学计量，扩展了脱细胞基质的生物学保真度。这种人源为转化性OoC模型，特别是患者相关或疾病特异性应用，提供了明确的概念优势。然而，hdECM与异种dECM共享许多相同的实际局限性，包括溶解后极端的力学顺应性、供体间变异性、有限的力学可调性，以及频繁需要支撑性或复合材料以实现装置集成。因此，虽然hdECM代表了朝向OoC系统中人源化ECM环境的一条引人注目的途径，但其当前的使用凸显了在可重复性、力学控制和可扩展性方面的持续挑战，这些挑战继续推动着混合和工程化材料策略的发展。
